中国新药杂志 2000年第7期第9卷 实验研究

作者：杨连春王峰刘敏吕敏贾恒明房秀华李展

单位：杨连春王峰刘敏吕敏贾恒明（中国人民解放军空军总医院,北京 100036）；房秀华李展（中国医学科学院药用植物研究所，北京 100090）

关键词：红背丝绸；白藜芦醇；内皮素；内皮素拮抗剂

【摘要】目的：研究我国广西抗蛇毒中草药红背丝绸［Cissus assamica (Laws.) Craib］对内皮素-1（endothelin-1, ET-1）的拮抗作用。方法：对红背丝绸进行提取分离，用不同提取物拮抗ET-1引起的小鼠急性死亡、大鼠离体血管条收缩和整体大鼠升压作用。结果：红背丝绸乙醇提取物、乙醇提取物之乙酸乙酯萃取物以及从乙酸乙酯萃取物中分离得到的白藜芦醇（resveratrol）在整体和离体水平对ET-1均具拮抗作用。该3种提取物对ET-1 致小鼠急性死亡有明显的保护作用，亦可明显地拮抗由ET-1引起的离体大鼠主动脉条的收缩并呈剂量依赖性，并且能够拮抗ET-1导致的大鼠血压的上升幅度。结论：红背丝绸及其有效成分白藜芦醇对ET-1具有生物效应拮抗作用，提示从某些抗蛇毒中草药寻找ET拮抗剂是可行的。

【中图分类号】R979.5【文献标识码】A【文章编号】1003-3734(2000)07-0455-04

The anti-endothelin-1 effects of Cissus assamica

yANG Lian-chunWANG FengLIU MinLU MinJIA Heng-ming

（General Hospital of Airforce,PLA,Beijing 100036）

FANG Xiu-huaLI Zhan

（Institute of Medicinal Plant Development,Chinese Academy of Medical Science,Beijing 100090）

【Abstract】Objective:To evaluate the anti-endothelin-1(anti-ET-1)effects of Cissus assamica,an herbal medicine from Guangxi province for treating snake bite.Methods:The extract of the herbal medicine was used to antagonize the sudden death of mice,the constriction of isolated rats'aortic ring and increase in blood pressure of rats caused by ET-1.Results:All extracts including ethanol extract and EtOAc extract of the former extract,and resveratrol isolated from EtOAc extract have anti-ET-1 effect.The 3 extracts have obvious protective effects against the sudden death of mice caused by ET-1.ET-1 caused constriction of isolated aortic ring and BP increase in rats can also antagonized by them.Conclusion:The anti-ET-1 effects of Cissus assamica and its active ingredient resveratrol suggest that it is possible to obtain anti-ET-1 agents from some kinds of herbal medicine for treatment of snake bite.

【Key words】cissus assamica；resveratrol；endothelin；endothelin antagonist

内皮素（endothelin,ET）是由Yanagisawa等发现的由3种活性多肽（ET-1，ET-2，ET-3）组成的家族，是目前已知的最强的缩血管物质之一^［1，2］ 。蛇毒sarafotoxins是从以色列毒蛇穴蝰（Atractaspis engaddensis）的蛇毒中提取的一类毒素，国外研究发现ET和这些蛇毒（以及蜂毒、蝎毒等相关肽）由同一祖基因演变而来，ET与sarafotoxin 约有60%～80%氨基酸同源，并且两者具有相似的受体分布和生物学效应^［3，4］ 。从ET与这些蛇毒的相近关系出发，我们开始探索我国的抗蛇毒中草药对内皮素生物活性的影响。红背丝绸是我国广西民间用于治疗毒蛇咬伤的一种草药，其药用部位为葡萄科植物枫叶藤［Cissus assamica (Laws.) Craib］的干燥根^［5］ 。我们通过筛选工作发现其醇提物对ET-1具有拮抗作用，提示含有拮抗ET-1的活性成分^［6,7］ 。本实验将报告这种药用植物的提取物对ET-1的拮抗作用以及一种非肽类内皮素拮抗剂——白藜芦醇(resveratrol)。

材料与方法

1实验仪器

Kofler显微熔点测定仪；岛津UV-3000型紫外光谱仪；PE 938G型红外光谱仪；MAT 711型EI-MS仪；Bruker AM-500型NMR仪；RBP-1型鼠尾血压计（中日友好医院出品），台式平衡记录仪（上海大华仪表厂出品）。

2实验材料

ET-1购于美国Sigma公司；红背丝绸采于广西平乐县，经作者鉴定为葡萄科植物枫叶藤的干燥根；实验所用溶剂为分析纯及化学纯；柱层析及薄层层析用硅胶H为青岛海洋化工厂产品；昆明种小鼠和SD大鼠分别购于中国医学科学院药物研究所实验动物繁育场和北京医科大学动物部（均有等级动物合格证）。

3实验用植物材料的提取、分离与鉴定

3.1实验用植物材料的提取、分离红背丝绸根10kg（干品），粉碎后用95%乙醇回流提取，乙醇提取物滤过后真空浓缩，该醇提物（AE，230g）经药理实验证明具拮抗活性；将AE充分分散于水中，分别以石油醚、氯仿和乙酸乙酯萃取，各萃取部分均用真空浓缩，其中乙酸乙酯萃取部分（EF，95 g）表现出拮抗活性；EF经硅胶柱层析分离，以石油醚-乙酸乙酯（9∶1～5∶5）梯度洗脱，得到结晶Ⅰ～Ⅲ，其中结晶Ⅲ（1.2g）显示有拮抗活性。

3.2结构鉴定结晶Ⅰ：白色针状结晶，mp138～140℃。UVλ^EtOH_maxnm(ε)：206。EI-MS m/z：414(M⁺),399,107,105,95,93,91,81,67,计算机检索提示为β-谷甾醇。IR(KBr)cm^-1：3 400，2 930,1 610,1 460,1 380,1 050，与β-谷甾醇标准品一致。鉴定为β-谷甾醇。

结晶Ⅱ：白色针状结晶，mp238～240℃(分解)。FeCl₃反应阳性,溴酚蓝反应阳性,紫外光下呈蓝色荧光。UVλ^EtOH_maxnm(ε)：216,271。EI-MS m/z:170(M⁺),153,135,125,107,96,79。JH1，D，Z-NMR(DMSO-d₆)δppm：12.2(1H,s),9.16(2H,s),8.8(1H,s),6.9(2H,s)。JC13，D，Z-NMR(DMSO-d₆)δppm：167.3,145.3,137.9,120.4,108.7。由以上数据推断结晶Ⅱ可能为没食子酸。与没食子酸标准品对照，其mp、共TLC完全一致，鉴定为没食子酸。

结晶Ⅲ：白色结晶，mp258～260℃。紫外光下呈蓝色荧光。EI-MS m/z：228(M⁺ ),211,199,181,157,115,91,分子式为C₁₄H₁₂O₃，不饱和度Ω=9。IR(KBr) cm^-1：3 280,1 600,1 580,1 410,1 150。JH1，D，Z-NMR(DMSO-d₆)δppm：9.5(1H,s),9.2(2H,s),7.4(2H,d,J=8.5Hz),6.9(1H,d,J=16Hz),6.8(1H,d,J=16Hz),6.7(2H,d,J=8.5Hz),6.4(2H,d,J=1.8Hz),6.1(1H,s )。JC13，D，Z-NMR(DMSO-d₆)δppm：158.4,157.1,139.1,127.9,127.8,127.7,125.6,115.4,104.2,101.7。以上数据与文献报道的白藜芦醇的数据基本一致^［8］，故鉴定为白藜芦醇（结构为3，5，4’-三羟基反式）。

4拮抗ET活性实验

4.1体外灌流拮抗ET-1收缩血管作用雄性SD大鼠，体重220～240g，击昏后摘取胸主动脉，仔细分离脂肪及组织，并剪成2～3mm宽的血管环，分别置于Krebs-Henseleit生理溶液［K-H液，95%O₂+5%CO₂，（37±0.5）℃］中，调整基础张力为2g，平衡60min后，用1×10^-7mol/L的去甲肾上腺素预激，平衡后加入ET-1 1×10^-9mol/L，待达到最大收缩效应后，分别加入不同浓度药物AE，EF和Res（用2%的DMSO为溶媒，并用2%的DMSO作对照），经张力换能器连接台式平衡记录仪，分别记录血管条的张力变化。

4.2拮抗ET-1的升压作用雄性SD大鼠，体重220～240g，用鼠尾血压计测定大鼠尾动脉压。分别灌胃给予AE（3g/kg和30g/kg），EF（2.5g/kg和5g/kg），40min后分别尾静脉注射ET-1 6μg/kg，测定大鼠尾动脉压；Res尾静脉注射5mg/kg和10mg/kg后，即刻分别从尾静脉再给予ET-1 6μg/kg，测定大鼠尾动脉压。以等体积生理盐水组对照，以给药前为基础值，记录收缩压的变化。

4.3拮抗ET-1致小鼠急性死亡作用雄性昆明种小鼠，体重18～22g，分别灌胃给予AE 30g/kg及EF 5g/kg，腹腔注射Res 10mg/kg，药物灌胃30min及腹腔注射15min后，分别尾静脉注射ET-16nmol/kg，用不加药物处置的生理盐水作对照， 观察15min内小鼠的存活情况，超过15min按15min计，记录动物死亡时间。

结果

1体外灌流拮抗ET-1收缩血管作用

在无实验药物的情况下，ET-1（1×10^-9mol/L）对离体大鼠主动脉条产生收缩作用，当分别加入AE，EF和Res后呈现舒张作用，其拮抗ET-1缩血管效应药效动力学参数见表1。

表1红背丝绸不同提取成分对ET-1缩血管