摘要利用差示技术从红豆杉悬浮细胞中克隆出茉莉酸类诱导表达的基因，并用异源表达系 统对有关基因进行功能鉴定，从而阐明紫杉醇生物合成机制，为今后解决红豆杉悬浮法生产 细胞紫杉醇产量低且不稳定的难题提供理论依据和技术手段。

STUDY ON MECHANISM OF TAXOL BIOSYNTHSIS BY JASAMONATES AND

MRNA DIFFERENTIAL DISPLAY

Qiou DeyouZhu Weihua Wu Yunqi et al.

（Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry, Beijing 100091）

ABSTRACTIn order to understand the mechanism of taxol biosynthesis, a new idea of using Jasamonates and mRNA differential display to clone the jasamonates elicited gene in taxus suspension cells and their functional analysis with heterologous expre ssion system is proposed. This strategy may provided a solution to the problem o f low and unstable taxol yield in taxus suspension cells.

KEY WORDSmRNA differential display; Jasmonates; Taxol biosynth esis

1茉莉酸类物质的研究概况及功能

茉莉酸类物质是一类特殊的环戊烷衍生物型植物激素,已知 的约有20余种^［1］。在自然界最早发现的是左旋茉莉酸甲酯［(-)-Ja-Me］。196 2年,Demole 等^［2］(Jasminum officinale var.grandiflorum)把它作为一种有香气的化合物从茉莉属的素馨花中分离出来,并用作香料工业生产中的一个重要 原料成分。到19 67年,Crabalona 又从白花迷迭香(Rosmarium grandiflorum)发现并分离出了这类物质, 以后 发现苦蒿(Artemisia absinthium)的叶片和茎中也有Ja-Me^［3］。游离的茉莉 酸 ( Ja) 首先是从真菌(Lasiodiplodia theobromae)培养液中分离出来的^［4］, 后 来发 现许多植物都含有Ja。迄今在多达150个科206 种植物中发现有茉莉酸类物质的存在。茉莉 酸类物质在植物组织中的含量高的可达10～30μg／g鲜重,低的仅为10～100ng／g鲜重。而 植 物悬浮细胞中茉莉酸类物质的含量仅为0.1～1ng/g,比植物组织中茉莉酸类物质的含量要 低2个数量级^［5］。研究表明,茉莉酸类物质的生物合成是通过脂氧合酶途径,即亚 麻酸经脂氧合酶催化加氧作用,产生脂肪氢过氧化物, 然后在氢过氧化物脱氢酶的作用下,产 生环氧亚麻酸,之后再在丙二烯氧化物环化酶的作用下,形成环戊烯衍生物12-氧-植物二烯 酸,再经还原及3次β-氧化作用,最后形成(+)-7-epi-Ja。 通过对茉莉酸类物质生理功 能 的研究,发现它对植物的生长发育具有广泛的生理功能,这些生理功能主要集中表现在2个方 面,即对生长的抑制作用和对衰老的促进作用^［6］。

用来源于真菌的激发子或真菌的细胞壁制剂可诱导悬浮培养的植物细胞产生相对分子质 量低的次生代谢物质, 这类物质在植物防止病原体侵害中起重要作用。研究结果表明,真菌激发子能刺激双子叶植物、 单子叶植物和裸子植物悬浮培养细胞内源3R,7S-茉莉酸的累积，例如灰白毛萝芙悬浮培养细胞在受到真菌激发子作用后，茉莉酸水平迅速从25上升到1 370ng／( g^．dw),相对分子质量低的次生代谢物质的合成量与内源3R,7S-茉莉酸的累积具有相关 性^{［7 ］} 。Francesch等^［8］在1991 年发现低含量的挥发性外源茉莉酸甲酯可诱导大豆小苗 花色素苷和营养贮藏蛋白的合成。Gundlach等于1992年也报道外源茉莉酸甲酯处理可诱导黄 堇、猪屎豆、花菱草、大豆、莴苣、番茄、萝芙木、茜草、芸香等36种单子叶及双子叶植物 悬浮培养细胞苯丙氨酸氨基裂解酶基因的重新转录，最终导致相对分子质量低次生代谢物质 的积累 。用茉莉酸生物合成前体及中间产物，如α-亚麻酸和12-氧-植物二烯酸处理也能诱导悬 浮培养的植物细胞大量合成的次生代谢物质^［9］。外源茉莉酸甲酯还可促进紫草悬 浮细胞迷迭香酸和长春花小苗生物碱的积累^{［10，11］}。1996年Yukimune等^{［12 ］}在培养 基中加入100μmol茉莉酸甲酯后使杂种红豆杉(Taxus.media)、欧洲红豆杉(T.b acca) 和太平洋红豆杉(T.brevifolia)培养细胞紫杉醇的产量由原来的（28.2±2.4），（0.4±0.0）和（0.2±0.0）mg/L分别提高到（1 10.3±4.9），（48.3±2.5）和（0.5±0.1）mg/L。同年Mirjalili等^［13］也 发现10mol的茉莉酸甲酯和0.0005%乙烯可使东北红豆杉(T.cuspidata) 悬浮细胞的 紫杉醇产量提高了19倍(由原来的0.19提高到3.4mg/L）。茉莉酸甲酯对紫杉醇生物合成 的这种作用又被Furmanowa等^［14］和Moon等^［15］的试验结果所证实,他们分 别把杂种红豆杉和欧洲红豆杉培养细胞紫杉醇的产量由原来的2.37μg/g和1.6mg/L干重提高到90μg/g和2.3mg/L干重。Yukimune等^［12］和Moon等^［15］同时发现茉莉酸甲酯还可使红豆杉培养细 胞另一种紫杉烷类化合物baccatin III的产量大幅度提高。上述结果充分表明，茉莉酸类物质是 诱导植物次生代谢物质生物合成的一种信号分子。

2紫杉醇生物合成的研究概况

作为红豆杉植物次生代谢产物之一的紫杉醇是近20年来抗癌药物研究领域的重 要发现。临床试验结果表明，紫杉醇对晚期卵巢癌、转移性乳腺癌和非小细胞肺癌有很好的疗效,对头部、颈部、 淋巴组织、膀胱、骨髓、食管等癌症也有一定疗效。该药于1992年底被美国 食品和药物管理局(FDA)批准用于治疗晚期卵巢癌,是一种具有发展前途的新药,预计该药在2 1世纪全球每年的销售额可达60亿美元。

红豆杉属植物全世界有11个种，我国也有4种和1个变种, 即西藏红豆杉(Taxus walli chiana Zucc)、云南红豆杉(Taxus yunnanensis Cheng et L. K. Fu)、红豆杉［T. chinensi s (pilger) Rehd.］、东北红豆杉(T. cuspidata Sieb. et Zucc.)和南方红豆杉(变种)(T. chinen sis Rehd. var. mairei Cheng et L. K. Fu.)，但全世界资源总量却极其有限，且常常散 生分布于天然林中。据估计,在我国红豆杉仅有100万株左右。 目前 , 紫杉醇主要利用红豆 杉科红豆杉属植物的树皮来分离提取。

为了从根本上解决紫杉醇的长期供应问题,国内外学者在红豆杉的人工栽培、紫杉醇的化学合成、内生真菌或微生物的分离与培养和细胞培养等领域进行了许多有意义的探索，取得了一些进展。紫杉醇的化学合成已经成功,但需要近30步化学反应,产率低、成本高, 虽然利用baccatinⅢ或10-deacetylbaccatinⅢ 为原料通过4步反应可合成紫杉醇及其类似物, 但这种半合成法仍然依赖于红豆杉枝叶这一有限的自然资源,且成本也很高;红豆杉在自然条件下生长非常缓慢, 而且大多数红豆杉枝叶中紫杉醇的含量仅为树皮中的五分之一, 因此利用人工栽培方法来获取大量的紫杉醇也面临不少问题。而采用红豆杉细胞法获得紫杉醇不仅周期短(约30d) ,而且还具有不受自然条件限制的优点, 是解决紫杉醇药源问题的较优途径之一。目前世界至少有十几家实验室从事这方面的研究，已有不少文章发表和专利公布^{［12～15］}。到现在 为止,国内外红豆杉培养细胞中紫杉醇产量通常都不高, 即使是偶尔报道获得较高的产量也 都存在产量不稳定的问题^{［12～15］}。很显然,现在利用红豆杉细胞悬浮培养法还无 法进行紫杉醇的工业化生产。究其原因, 主要是由于人们对紫杉醇生物合成的部位、途径及 其调控机制还不甚清楚,特别是对紫杉醇生物合成途径中的关键步骤(即限速步骤)及其调控 机制了解不多所致。

有关紫杉醇生物合成部位的研究已有一些报道。Strobel等^［16］认为对整株 红豆杉植物而言,树冠上部枝条、根、根茎连结处以及侧枝的树皮合成能力都不如主茎树皮的合成能力强 ，而树皮中合成紫杉醇的能力又以内层韧皮部和白色的形成层组织最强。Smith 等利用免疫金标记的紫杉醇抗体发现金颗粒存在于红豆杉细胞的大的质体中,从而认为紫杉醇的生物合成是在红豆杉细胞的质体中进行^［17］。这一结果被Srinivasan等 ^［18］的试验所证实：用1和10μmol环己亚胺(细胞质蛋白质合成抑制剂)处理 红豆杉细胞,其紫杉醇的产量均不受影响; 当加入1μmol的链霉素(质体蛋白质合成抑制剂) 几乎不影响红豆 杉细胞紫杉醇的产量,而10μmol链霉素则完全抑制了红豆杉细胞紫杉醇的生物合成,致 使培养 细胞中检测不到紫杉醇的存在。除了质体中检测到紫杉醇的存在外，原生质体外的细 胞壁（红豆杉幼茎韧皮部、维管束形成层以及木质部细胞的细胞壁）也检测到了大量的紫杉醇的存在^［19］。所以，紫杉醇可能是在红豆杉细胞质体中合成后最终积累在原生质体外的 细胞壁中。

有关紫杉醇生物合成途径的研究也有一些报道。一般认为, 紫杉醇的生物合成包括紫杉醇侧链的生物合成和紫杉醇骨架的生物合成两部分。用酸水解紫杉碱后形成(3R) -二甲基-3-苯丙氨酸( winterstein acid)，而苯丙氨酸被认为是其最好 的前体^［20］。用放射性同位素标记的前体进行喂饲试验的结果表明,紫杉醇C13位酯基侧链 上C₆H₅CHCH(OH)COO基团来自苯丙氨酸。Fleming等^［21］用同位素标记技术证明， 苯丙氨酸首先在氨基变位酶的作用下形成β-苯丙氨酸,β- 苯丙氨酸经C2位羟基化后形成苯基异丝氨酸(phenylisoserine),苯基异丝氨酸与紫杉醇的骨架部分(如Baccatin III)相连且苯基异丝氨 酸的NH₂ 基团被苯基化后才合成其完整的侧链部分^［21