摘要目的：探讨阿蒂莫耶番荔枝总内酯(AA)及其单体bullatacin和atemoyacin-A克服肿瘤多药抗药性（MDR）的作用及其机制。方法：用两对MDR 细胞株及其相应的敏感株进行对比研究。结果：AA及其单体具有极强的细胞毒作用，且对MDR细胞与其相应的敏感株的IC₅₀相近(P＞0.05)。加入AA，bullatacin和atemoyacin-A 能使MDR细胞内Fura-2分别增加2.39，3.14和3.24倍，但不能增加敏感细胞Fura-2 的积累量。细胞内阿霉素(ADR)的积累与Fura-2 相似，加入AA，bullatacin和atemoyacin-A均分别增加 MCF-7/ADR 细胞内 ADR 的积累至2.98，4.10和4.24倍，而未见显著增加敏感株内 ADR 的积累。bullatacin和atemoyacin-A均能诱导MCF-7与MCF-7/ADR细胞的凋亡，且相同浓度下，两细胞株的凋亡百分数无显著差异。MDR 细胞株与其相应的敏感株 bcl-2 蛋白表达水平均较低，且无明显差异。加入bullatacin 对MDR 细胞株与其相应的敏感株bcl-2 蛋白表达水平均未见明显影响。结论：AA及其单体对 MDR细胞无抗药性，其机制与增加MDR细胞内抗癌药物积累增加有关。AA诱导细胞凋亡的机制及诱导MDR细胞凋亡在克服肿瘤MDR中的作用有待进一步研究。

THE CIRCUMVENTION OF TUMOR MULTIDRUG RESISTANCE(MDR)BY

ANNONACEOUS ACETOGENINS AND ITS MECHANISM

Fu Liwu,Yang Ankui,Pan Qichao,et al.

(Center for Prevention and Treatment of Cancer,Sum Yatsen

University of Medical Sciences,Guangzhou 510060)

ABSTRACTOBJECTIVE：Annonaceous acetogenin and its principles including bullatacin and atemoyacin-A were obtained from atemoya plant.The study is aimed at exploration of the MDR circumvention and its mechanism of AA and its principles.METHODS:To compare the MDR cell lines with their parental sensitive cell lines including MCF-7/ADR cells,MCF-7 cells,KBv200 cells and KB cells.RESULTS:AA and bullatacin and atemoyacin-A,had very potent cytotoxicity to MCF-7/ADR,MCF-7,KBv200 and KB cells and the IC₅₀ of MDR was similar to that of the parental sensitive cell lines.The endocellular Fura-2 increased to 2.39，3.14，and 3.24 fold respectively by addition of AA,bullatacin and atemoyacin-A and the accumulation of Dox in MCF-7/ADR cells was similar to that of Fura-2,increased to 2.98,4.10 and 4.24 fold respectively by AA,bullatacin，and atemoyacin-A while no in MCF-7 cells.The apoptosis of MCF-7 and MCF-7/ADR cells can be induced by both bullatacin and atemoyacin-A and no significant difference in apoptosis rate at similar concentrations.Bcl-2 protein expression of both MDR and their parental sensitive cells was low with no significant difference and do not affected by bullatacin.CONCLUSION:AA,bullatacin,and atemoyacin-A have no drug resistance to MDR cells and the mechanism for circumvention of MDR is related to increase of MDR cellular drug accumulation.Apoptotic action in circumvention of MDR will be studied in the future.

KEY WORDSAnnonaceous acetogenin；Bullatacin；Atemoyacin-A；Multiple drug resistance；Apoptosis；Fura-2

多药抗药性(MDR) 是指肿瘤细胞对一种来源于天然的抗肿瘤药物产生抗药性的同时对结构和作用机制不同的多种天然来源的抗肿瘤药物产生交叉抗药性。已证实P-糖蛋白(P-gp)过度表达将药物外排是产生MDR的主要原因^［1］。实际上，P-gp是一种依赖于三磷酸腺苷(ATP)的外排泵，能将抗癌药物从肿瘤细胞内排至细胞外， 从而使肿瘤细胞内的抗癌药物浓度降低，因此产生MDR。MDR是肿瘤化疗失败的主要原因，也是肿瘤化疗领域急需解决的难题。

理论上，克服MDR有二种途径：其一是寻找一些高效、低毒，能用于临床的MDR逆转剂。为了寻找逆转剂，人们已进行了较广泛的研究，发现部分钙通道阻滞剂、钙调素的抑制剂、环孢霉素类以及多种多样的亲脂性化合物在体外均具有部分或完全逆转MDR的作用，但却不能用于体内， 这主要是由于其毒副作用在体内不能达到逆转MDR的有效血药浓度。到目前为止，尚未找到可用于临床的理想逆转剂。其二是寻找一些对MDR细胞无抗药性的新的抗癌药物，目前正处于起步阶段，可能成为克服MDR的新的研究方向。

自1982年Jolad等发现第一个番荔枝内酯化合物后，对其研究进展很快,至今已发现这类化合物近200多种，它们具有多种生物学活性， 是目前报道中体内外抗癌活性最强的化合物之一。

番荔枝内酯类化合物的作用靶点为肿瘤细胞的线粒体，其机制为特异性地抑制肿瘤细胞的线粒体NADH的还原酶或氧化酶，从而阻断电子的传递，减少ATP的生成，抑制线粒体的供能功能^［2］。

Coley等^［3］报道MDR细胞内抗癌药物的积累呈能量依赖性，这提示细胞内ATP的供应量可能将影响P-gp的功能。

P-gp是一种依赖于ATP的抗癌药物外排泵， 而番荔枝内酯的作用是阻断呼吸链的传递，使细胞内ATP迅速减少。那么番荔枝内酯对MDR肿瘤是否有效？与其使 MDR细胞内的ATP迅速降低，从而使P-gp丧失其功能是否有关？本实验就此问题进行探讨。

材料与方法

1材料

阿霉素(ADR)为华明制药厂产品，Fura-2，Fura-2-AM，噻唑兰(MTT)均为Sigma 公司产品。

华南植物研究所陈文森等从阿蒂莫耶植物种子中提取番荔枝总内酯(AA)，含量极为丰富（提取物占种子的4％），从这种粗提物中分离得到12 种具有很强抗肿瘤活性的单体，其中10种为：bullatacin，asimicin，molvizarin，rollinicin，motrilin，desacetylu-varicin，neoannonin，cherimolin，almunequin，squamo-

cin-K ，2 种为新的AA，即atemoyacin-A和atemoyacin-B。这种粗提物中活性物质含量高，如bullatacin在本植物种子中含量为万分之五(而文献报道最高为十万分之五)^［4,5］。

阿蒂莫耶植物种子中AA可能不仅含有多种抗癌成份,而且活性还相当强。陈文森教授提供了AA及多种单体，以少许二甲基亚砜溶解，加磷酸缓冲液(PBS)配成所需浓度， 二甲基亚砜最终浓度不超过0.2％。

细胞系及细胞培养：MCF-7/ADR，MCF-7细胞株由北京肿瘤研究所赠送(来源于美国国立癌症研究所)，已证实MCF-7/ADR能稳定表达P-gp^［6］，具有典型的MDR，对ADR的抗药性是敏感株的66倍。将其培养于DMEM培养液中，内含10％小牛血清，青霉素100 IU/ml和链霉素100 μg／ml，置于37℃含5％CO₂的孵箱中培养。

KB细胞和KBv200细胞培养在含10％小牛血清的RPMI1640培养液内，置37℃含5％CO₂温箱中培养。

KBv200细胞是用对长春新碱(VCR)敏感的KB细胞为亲本，通过诱变剂甲基磺酸乙酯剌激，然后在培养液中加入浓度递增的VCR诱导而得，在VCR浓度为200 nmol/L时生长良好，较KB细胞对VCR耐药100倍。

KB细胞及KBv200细胞均为中国医学科学院药物研究所提供。

2方法

2.1细胞生长抑制实验本实验以MTT法进行^［7］。分别计算抑制细胞生长达50％时的药物浓度，以IC₅₀值表示。

2.2P-gp功能测定Fura-2-AM(荧光试剂)是P-gp的底物，可被P-gp外排，使MDR细胞内的Fura-2 (Fura-2-AM在细胞内酯解为Fura-2和AM)积累减少。若P-gp的功能降低或丧失，MDR 细胞内 Fura-2积累则增加。分别加入5，1×10^-2，1×10^-2 μg/ml的AA，bullatacin，atemoyacin-A共同培养12h，收集细胞，按Fura-2-AM法进行^［8］。

2.3细胞内ADR积累的测定分别加入5，1×10^-2，1×10^-2 μg/ml的AA，bullatacin，atemoyacin-A共同培养12h,收集细胞，以荧光分光光度计法进行测定^［9］。

2.4细胞凋亡的测定分别加入5，1×10^-2，1×10^-2 μg/ml的AA，bullatacin，atemoyacin-A 共同培养12h，收集细胞，按流式细胞仪法进行测定^［10］。

2.5bcl-2蛋白表达测定加入1×10^-4 μg/ml的bullatacin 作用24h， 按流式细胞仪法测定^［11］。

结果

1AA及单体对MDR细胞株及相应的敏感株生长的影响

结果表明这种AA及其单体具有较强的体外抗肿瘤作用，同时，以具有MDR的细胞株与敏感细胞株（MCF-7/ADR与MCF-7，KBv200与KB）的IC₅₀进行比较，均无显著性差异（P＞0.05），表明MDR细胞株对AA及单体均无抗药性，见表1。

表1AA及单体对MDR细胞株及相应