摘要目的：制备与鉴定人类天然杀菌及通透性增强蛋白，寻找抗LPS新药。方法：自慢性粒细胞性增生患者全血提取人粒细胞杀菌蛋白(BP)。SDS-PEGE电泳测定分子量，水解法测定氨基酸组成，普通细胞菌培养检测对O₁₁₁B₄大肠杆菌的杀伤作用。体内鉴定采用腹腔脓毒症小鼠模型，与抗内毒素单克隆抗体1A比较。观察指标：血LPS使用定量的鲎试剂分析法。血细胞因子活性：IL-1采用小鼠胸腺细胞增值法；IL-6采用小鼠淋巴细胞系7TD₁细胞增值法；TNF采用L929细胞溶解法。结果：得到55KD蛋白，具有杀菌和中和LPS特性。该蛋白体外中和LPS的能力强于1A。小鼠脓毒症模型血LPS水平：BP和1A组明显低于NS组(P＜0.05)。血细胞因子活性：BP组的抑制作用较强，IL-1，IL-6和TNF活性均低于NS组，有显著性差异(P＜0.05)；1A只对IL-6有抑制作用(P＜0.05)。结论：BP在阻断LPS和抑制炎症反应方面优于抗LPS单抗。

PURIFICATION AND CHARACTERIZATION OF HUMAN PROTEIN WITH

ENDOTOXIN-NEUTROLIZING AND BACTERICIDAL PROPERTIES

Zhang Haiying,Li Xinjian,Meng Xianjun

(Department of Experimental Surgery,General Hospital of PLA,Beijing 100853)

ABSTRACTOBJECTIVE：In search for new anti-LPS agent,an human protein with bactericidal and permeability-increasing proteins has been purified and characterized.METHODS:The human bactericidal protein(BP)was extracted from blood of patients with chronic myelocytic leukemia,and its molecular weight,amino-acid compositions,and bactericidal ability for E.coli O₁₁₁B₄ were determined by SDS-PEGE,hydrolysis,and co-culture with BP respectively.Its endotoxin-neutrolizing property was determined quantitatively by limulus amebocyte lysate test.Its in vivo characterization was conducted in model of NH1 male mice with abdominal infection in comparison with monoclonal antibody 1A.Activities of cytokines of IL-1,IL-6,and TNF for septic mice were measured by enhancing mitogenic response of thymocytes to Con A,IL-6-dependent murine hybridoma cell line 7TD₁ and L929 cytolutic assay respectively.RESULTS:A 55KD protein with bactericidal and LPS-neutralizing properties was obtained.Its in vitro ability to neutralize LPS was stronger than that of 1A.The blood LPS level in 1A and BP groups was significantly lower than that of NS(P＜0.05).BP was much stronger in in vivo and in vitro endotoxin-neutralizing ability than that of 1A.CONCLUSION:The results suggested that BP might be a more powerful anti-inflammatory agent in treatment of bacterial infections in comparison with anti-LPS antibodies.

KEY WORDSBactericidal protein(BP);Sepsis;Endotoxin;LPS;Monoclonal antibody

用抗内毒素单克隆抗体治疗脓毒症已经进入Ⅲ期临床试验，没有获得预想的疗效^［1］。杀菌及通透性增强蛋白(bactericidal and permeability increasing protein，BP)是另一种有希望的内毒素脂多糖（LPS）阻断剂。它与抗LPS单抗比较，与LPS的结合是化学性的。最近的动物实验和临床研究证明，它在中和LPS的特异性和亲和性上、以及控制炎性细胞因子等诸多方面优于单克隆抗体。为此，我们自行制备了人粒细胞杀菌蛋白，并对其杀菌和中和内毒素作用加以鉴定，现将结果报告如下。

材料与方法

1主要仪器与试剂

慢性粒细胞增生患者全血（本院低温研究室提供）；抗LPS单抗1A(IgM, 饱和硫酸铵沉淀纯化，本室制备) ；重组人IL-1，IL-6和TNF标准品（北京邦定生物公司）；1640培养基（美国GIBCO公司）；新生小牛血清（NBS，天津生物制品所）；鲎试剂盒II型（购于上海医学化验研究所）；低温层析冷柜（解放军军事医学科学院制造）；葡聚糖凝胶SepHadex G75(40～120 μm，Pharmacia)；CM₅₀阳离子交换树脂（匈牙利产）。

2动物

脓毒症模型采用NH₁雄性小鼠，10周龄，ip O₁₁₁B₄大肠杆菌生理盐水悬液0.5ml，浓度为4.6×10⁷～5.6×10⁷个/ml (1/2 LD₉₀)，bid，q12h。

3方法

3.1分离纯化^［2～4］① 多核粒细胞的分离：慢性粒细胞增生患者全血加入梯度Ficoll液离心管中（含Ficoll上层16％，下层25％），1 500 r/min离心15 min，吸取下层，加3倍体积的4℃生理盐水，混匀后500 r/min离心8 min，弃上清液，共3次。② 多核粒细胞提取物的制备：以0.1 mol/L，pH 4.0醋酸钠稀释细胞浓度为2×10⁶/ml，4℃恒温12 h，恒温摇床摇动频率60次/min，低温25 000 r/min离心30 min，留取上清液。③ 纯化：SepHadex G75柱(2.6 cm×78 cm)，洗脱流速5 ml/h，以磷酸盐缓冲液淋洗，紫外检测仅有一个蛋白峰。再经CM₅₀离子交换柱层析(2.6 cm×20 cm)，使用0.1 mol/L，pH 5.0醋酸/醋酸钠缓冲体系，2.0 mol/L NaCl溶液连续梯度洗涤，收集到4个蛋白峰，按序编号为1#～4#。整个操作在4℃层析柜内进行。

3.2分子量鉴定^［4］CM₅₀分离的各蛋白峰经SDS-PEGE电泳。

3.3杀菌活性O₁₁₁B₄大肠杆菌经普通琼脂平板培养，收集后以生理盐水洗3次，比浊法设定细菌初浓度为6×10⁶/ml，10倍等比稀释6管；取层析前后各样品加入24孔板，初浓度为1.0 mg/ml，倍比稀释2次（1/2，1/4）；每一蛋白浓度加入等比稀释的细菌悬液，每孔0.5 ml。37℃恒温2 h，各取10 μl接种于普通琼脂平板，37℃恒温12 h，记录菌落数。判断标准如下：与单纯载体(0.1 mol/L醋酸钠缓冲液，pH 7.0)比较，菌落数之比≥0.75为“－”，≤0.758“＋”，≤0.50“++≤0.25“+++”，≤0.10“+++”。

3.4中和LPS活性使用鲎试剂盒II型，待测样品和稀释度同杀菌活性检测，与抗LPS单抗1A比较。

3.5氨基酸组成^［3］6 mol/L盐酸水解，110℃恒温22 h，用BECKMAN 6300高效氨基酸分析仪测定。

3.6治疗方案脓毒症模型小鼠50只，随机分为3组，每组16～17只，各组分别给予：1A 1.0 mg，BP 0.1mg，生理盐水(NS)，注射液体积0.5ml，均为每鼠剂量，于第一次攻击同时ip给药。

3.7观察指标血细胞因子活性及LPS水平定量分析。标本采集：每时间点每组6只小鼠，于第2次攻击后1，3，12 h采集3次血样。

3.7.1血浆LPS水平使用鲎试剂法，同上。

3.7.2细胞因子活性检测^［5］IL-1活性检测采用Con A协同的小鼠胸腺细胞增殖法：6周龄NH₁小鼠胸腺，用200 μm钢网研磨，收集细胞悬液，1 000 r/min离心8 min，弃上清液，用生理盐水、Hank's液洗，各反复洗2次，以含10％NBS，ConA 0.1 μg/ml的1 640（完全配基）调整细胞浓度为6×10⁵～7×10⁵个／ml；向96孔细胞培养板内加入完全配基40 μl，第1孔加入标本40 μl，等倍稀释4孔，设无标本阴性对照，重组人IL-1作为阳性标准。标本加入完毕后，每孔添加完全配基100 μl，CO₂培养箱内培养48 h，每孔加入2％MTT 40 μl，继续培养4～6 h，2 000 r/min离心20 min，弃上清液，每孔加入二甲基亚砜100 μl，20 min后在酶联仪上读取OD₅₄₀。

IL-6活性检测采用IL-6依赖性小鼠淋巴细胞系7TD₁细胞增值法：以含10％NBS的1640配基调整7TD₁细胞浓度为5×10⁵～6×10⁵个／ml，以后步骤同IL-1。

TNF活性检测采用在放线菌素D增敏的L929细胞溶解法：以含10％NBS的1640(含ConA)完全配基调整L929细胞浓度为5×10⁵～6×10⁵个／ml，以后步骤同IL-1。最后将OD₅₄₀值换算成细胞裂解百分比，公式为：

细胞裂解百分比（%）=(1－样本OD₅₄₀/阴性对照OD₅₄₀）×100%

4统计方法

使用计算机统计软件SAS，利用方差分析计算各组细胞因子活性以及LPS水平的差异。

结果

1分子量

各蛋白峰经SDS-PEGE电泳，可见清晰的55KD电泳带，见图1。

1^#～4^#为各蛋白峰，箭头处为55KD电泳带，M为分子量标准

1SDS-PEGE电泳图谱

2杀菌活性