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Aminoguanidine in inhibiting proliferation and matrix synthe sis of cultured rat pancriatic stellate cells stimulated by advanced glycosylati on end products
LIU Nai-Feng
(Department of Cardiology, Affiliated Hospital, Nanjing Rail way Medical College, Nanjing JIANGSU 210009)
ABSTRACTAIM: To investigate effects of aminoguanidine on ad vanced glycosylation end products(AGEs) in proliferation and matrix synthesis of cultured rat pancriatic stellate cells(PSC). METHODS: Proliferation of PSC was estimated by bromodeoxyuridine(BrdU) with time-resolved fluoroimmunoassay (TR-FI A). The fibronectin synthesis of rat PSC were observed by immunocyto chemistry and by TR-FIA. RESULTS: It was found that AGEs-BSA significantly stimulated prolife ration of PSC in a dose-related manner. The total fibronectin synthesis of PSC w as also increased by AGEs-BSA in a concentration-related manner. AGEs-BSA glyc osylated in the presence of aminoguanidine under anaerobic conditions showed red uced or no significant effects on cellular proliferation and fibronectin synthes is. CONCLUSION: Our result is that AG can inhibit the proliferation and matrix synthesis of PSC stimulated by AGEs.
KEY WORDSaminoguanidine; advanced glycosylation end products; diabetes mellitus; cultured cells; fibronectins
持续的高血糖状态会导致体内许多结构和功能蛋白质糖基化。这种转录后修饰过程，先形成可逆的早期糖基化产物、Schiff碱和Amadori产物，如临床常用的监测血糖控制指标糖化血红蛋白HbA1c便属其一。如反应继续，则分子重排形成一大类有高度活性的高级糖基化终产物(advanced glycosylation end-products，AGEs)。这类物质的共同特征是，形成缓慢，但不可逆，具有棕黄色素和特征性荧光光谱，能形成蛋白间的交链，与氧化修饰密切相关，能与特异胞膜受体结合介导各种细胞异常反应，因此在糖尿病慢性并发症的发生中占有重要地位［1］。糖尿病并发症共同的病理过程是纤维化，以间质细胞的增殖和基质的大量合成为特征。胰星状细胞（PSC）是胰腺组织中的主要间质细胞［2］。抗糖基化药物氨基胍（AG）在糖尿病慢性并发症的防治中有很好的前景。我们在培养的大鼠PSC上观察了AG对AGEs诱导的增殖和基质合成的影响。
材料与方法
材料细胞培养基(Dulbecco's modified eagle medium，DMEM, Bioch rom), 牛血清清蛋白(BSA, Sigma), 小牛血清(Boehringer Mannhein), 葡萄糖(Merck), 鼠抗溴脱氧尿核苷单克隆抗体(DAKO), 生物素标记兔抗鼠IgG抗体(DAKO), 镧标记链抗生物素蛋白(Eu-streptavidn，Wallac), 兔抗人纤连蛋白类多克隆抗体(Behring), 镧标记抗兔IgG 抗体(Wallac), 纤连蛋白对照品(Behring), 荧光染料(Bis-benzimid)和牛胸腺DNA对照品 (Sigma)。氨基胍（aminoguanidine, Sigma）。
高级糖基化终产物(AGEs-BSA)的制备将牛血清清蛋白与200 mmol·L -1的葡萄糖在37℃无菌条件下孵育8 wk后，对磷酸盐缓冲溶液(PBS)充分透析去除游离糖。再通过0.22 μ m的滤器除菌过滤，4℃保存备用。部分AGEs-BSA在糖基化过程中加入终浓度为 100, 200 mm ol·L-1的AG或10 μmol·L-1乙二胺四乙酸（EDTA）。
大鼠胰间质细胞的分离培养采用组织贴块外生长法。先将新鲜分离的大鼠胰腺组织在PBS中洗去血液和其他附着物，剪切为1 mm3的小组织块，置于6孔板中，用D MEM培养基，加10 %小牛血清、抗生素和谷氨酰胺，在37℃，5% CO2条件下静置培养。5～ 7 d后可见细胞从组织块边缘向外生长，融合约60%时传代。
免疫细胞化学将传代后的细胞种植于6孔板中，内置3～4片载玻片，融合至60%时，换新鲜培养液，加指定浓度的AGEs-BSA或AG处理的AGEs-BSA继续培养24 h后取出，用PBS漂洗，预冷的丙酮固定细胞。经PBS和小牛血清混合液阻断非特异性结合后，分别加抗纤连蛋白(FN)抗体(均为1∶50稀释)，孵育1 h，再加生物素标记的相应第二抗体和荧光素标记链抗生物素蛋白，间以充分的PBS漂洗，荧光显微镜下观察、摄影记录。
细胞增殖状态测定用非同位素的溴脱氧尿苷(Br dU)掺入法。第4～8代细胞用于实验。细胞传代后种植于24孔培养板中，待融合至80%时，换含 0.5%小牛血清的培养基培养24 h，使大多数细胞进入G0期。然后换为含指定浓度BSA和AGEs-BSA培养基，并加入BrdU继续培养24 h。细胞经PBS清洗后，用乙醇和冰醋酸(95/5)固定。加甲酰胺 250 μl 在80℃水浴中孵育45 min，使胞内DNA断裂，易被抗体识别。依次加入抗BrdU抗体(1∶500 )、生物素标记抗小鼠IgG抗体(1∶1000)、镧(Eu)标记链抗生物素蛋白(1∶1000)和镧增强液分别作用1 h，在Wallac 1232 DELFIA时间分辩免疫荧光仪上测Eu计数。
纤连蛋白的测定先用含0.1% 明胶的包被缓冲液4℃包被96孔板过夜，再用清洗缓冲液洗3次。将FN对照品储存液从5000 mg·L-1分步稀释到19.5 mg·L- 1，每孔加100 μl作为标准曲线。细胞上清液稀释20倍后，加100 μL为待测样本。经37 ℃振荡孵育1 h后，用自动洗板机洗3次。分别加1∶200 稀释的多克隆兔抗人FN抗体100 μ L 和1∶200稀释的镧标记抗兔IgG抗体各孵育1 h后，再加镧增强液作用1 h。用时间分辩免疫荧光测定仪计数，计算机应用程序拟合标准曲线，并计算出样本中FN浓度。所有测量均为复管，复管间变异系数小于10%。实验重复3次。
数据和统计学处理数据表示为±s 。用计算机统计程序Statistic Graphic方差分析(ANOVA)比较组间差异，P＜0.05为显著性检验标准。
结果
AGEs-BSA促进PSC基质合成的免疫组织化学特征PSC经鉴定，符合其形态学和免疫组织化学特征。如图1所示，用AG处理的AGEs-BSA刺激FN合成的作用明显减弱。
图1AGEs对PSC纤连蛋白表达的免疫细胞化学观察(×400倍)
A：对照组，含0.5%小牛血清；B：BSA 200 mg·L-1; C: AGEs-BSA 200 mg·L-1加AG 100 mmol·L-1; D：AGEs-BSA 200 mg·L-1
AG抑制BSA糖基化过程中的荧光值当BSA与500 mmol·L-1葡萄糖孵育后产生明显的荧光，AG 100 mmol·L-1能明显抑制荧光的发生，EDTA 10 μmol ·L-1也有部分抑制作用（图2）。
图2AG和EDTA对BSA糖基化过程中产生荧光的影响
葡萄糖(G, 500 mmol·L-1), AG(100 mmol·L-1), EDTA(10 mol·L-1)。BSA+G组与BSA组相比经t检验，cP＜0.01; BSA+G+AG组与BSA+G组相比经t检验，fP＜0.01; BSA+G+EDTA组与BSA+G组相比经t检验，iP＜0.01(±s, n=3)。
AG抑制AGEs对PSC合成FN的作用当PSC与AGEs-BSA 50, 200, 400 mg·L-1共同作用24 h后，FN的合成显著增加, 呈浓度依赖性。相同浓度但用AG 100 mmol·L-1处理的AGEs--BSA刺激FN合成的作用明显减弱(图3)。
图3AG对AGEs-BSA介导PSC合成纤连蛋白的影响
AGEs-BSA 200 mg·L-1组或AGEs-BSA 400 mg·L［-1］组与对照组比较，经t检验，bP＜0.05; AGEs-BSA 200 mg·L-1+AG组或AGEs-BSA 400 mg.-1+AG组与相应的AGEs-BSA组相比，经t检验，fP＜0.01(
