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Inhibitory effects of the four nomenclature of recipes on chemilumi nescence in whole blood and active oxygen
Long Shengjing(Long S J)，Zhu Chunling(Zhu CL)，Yang Yanbin(Yang YB)
(Department of Chemi stry，Guangxi Medical Universty，530021)
ABSTRACTOBJEC TIVE：To study the function of nomenclature of recipes on antiaging form t he respect of antioxidation.METHODS:The effects of the four nomencla ture of recipes on chemiluminescence in whole blood in vitro were measured by ch emiluinescence，and their inhibitory function on active oxygen were studied .RESULTS:The nomenclature of recipes inhibited the intensity of chem iluminescence from the phagocytic action of leukocytes in vitro obviously.They a lso scavenged superoxide anion radicals，hydroxyl radicals，hydrogen peroxide with dose-effect relationship.CONCLUSION:The four nomenclatures of reci pes have scavenging functions on active oxygen.The function may be related to th eir antioxidation.
KEY WORDSnomenclature of recipes，chemiluminesc ence in whole blood，active oxygen，antioxidant
衰老(Senility)是医 学研究的焦点问题之一，延缓衰老，延长寿命是人类的共同愿望，也是医学研究的最终目的 ［1］。现代医学关于衰老的论述很多，其中自由基学说认为，随着机体衰老，体内 自由基代谢紊乱，过多的自由基会通过多种作用使机体加快衰老［2］。为了防御自 由基的损害，可以向生物体内添加适量的抗氧化剂，从而达到抗老延寿的目的［3］ 。中药方剂在这方面具有经济易得，已有长期使用经验和毒副作用小等独特优势，其效果值 得深入研究。故在中药方剂中寻找和筛选具有良好的抗氧化作用的中药抗衰老方剂，这对探 索开发新保健药品，指导临床古方今用及了解中药方剂抗衰老的作用机理等都有益处。本文 采用化学发光分析方法，体外观察了一贯煎、八珍汤、十全大补汤和小建中汤这4种中药方 剂对全血化学发光的影响，并对其抗氧化作用进行了研究。结果报道如下。
1材料与仪器
1.1药材
组方中药购于南宁市医药公司。
1.2中药处方(单位:g)
(1)一贯煎(One Pentrating Decoction)北沙参10麦 冬10当归10生地黄30枸杞子12川楝子5。
(2)八珍汤(Eight Ingredient Decoction for Tonifying Energy and Blood)当归(酒拌) 10川芎5白芍8熟地(酒拌)15人参3白术(炒)10茯苓8甘草(炙)5。
(3)十全大补汤(Great Tonifying Decoction of Ten Drugs)人参8肉桂8川芎5地黄 (烧、酒蒸焙)15茯苓(烧)8白芍8白术(焙)10甘草(炙)5黄芪(去芦)15川当归(洗、去芦)10。
(4)小建中汤(Decoction of Small Strengthening Middle -jiao)甘草(炙)6大枣12枚白芍18桂枝9生姜9胶饴30。
以上(1)(4)中药处方 来源于文献［4］，(2)(3)中药处方来源于文献［5］。
1.3试剂
鲁米诺(德国Merck-Schuchrat公司)；酵母多糖(Sigma公司) ；酵母浸出汁为生化试剂；双氧水、连苯三酚、碳酸钠、碳酸氢钠等为国产分析纯试剂；所 用水均为双蒸水。
1.4仪器
DG3030发光光度计(南京华东电子管厂) 。
2方法
2.1试液的制备
按各方剂的处方剂 量减半称量，各味中药置于烧杯中，再按各方总重量的5倍加入双蒸水，电炉上煮沸30min， 棉花过滤，滤渣同上法再处理2次，每次加入3倍量的双蒸水，各煮沸20和10min，合并3次滤 液。滤液70～80℃水浴中浓缩至0.5g/ml(每ml试液相当于0.5g中药方剂量)，冰箱放置待用 ，取上部液体作为供试液，临用前，再依情况稀释。
2.2中药方剂水提液中固体物质含量的测定
准确量取供试液各2.00ml ，置于经洗净、干燥至恒重的称量瓶中，于120℃电热恒温干燥箱中干燥3.5h，冷后称量，平 行做2次，取平均值，以每毫升试液中含提取固体物克数(g/ml)表示。
2.3测定方法
2.3.1中药方剂对全血化学发光的影响的测定方法参考 文献［6］的方法改进。选用Wistar大鼠，后脚注射1%角叉菜胶(致炎剂)0.1ml，12h后 ，双脚水肿，眼球取血，肝素抗凝。抗凝血用Hanks液1∶8稀释，4℃冰箱保存备用，用时取0 .9ml稀血，加入不同剂量的供试液(空白不加)和50μl鲁米诺后，37℃恒温水浴箱中保温10mi n，然后加入5mg/ml的酵母多糖100μl，计时，混匀，置于37℃恒温水浴箱中保温至10min后， 置发光仪中，测定60s内发光强度的总值。样品平行测定3次，取平均值，按下式计算抑制率 。
2.3.2样品清除H2O2的测定方法参照文献［7］的方法略加改 进在测定管中加入500μl pH=10.77 0.2mol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲液，100μl 10mmol/L H2O2，加入不同量的试液(空白不加)，混匀，置发光仪中，于37℃加入500μ l 15mmol/L鲁米诺(用上述缓冲液配)与6mmol/L溴代十六烷基三甲胺(CTMAB)1∶1的混合液， 启动反应，测定10s内发光强度的平均值。每样品平行测定3次，取平均值，按下式计算清除 率。
2.3.3样品清除由碱性连苯三酚产生O÷2的非酶体系测定方法按文 献［8］的方法。
2.3.4样品清除羟自由基(∶OH)测定方法参照 文献［9］的方法略加改进1.8mmol/L维生素C用50mmol/L pH=6.2磷酸钠缓冲液配制 ，其余试剂都改用二蒸水配制。使用时试剂均放于37℃恒温水浴中。在测定管中加入1.8mmo l/L维生素C 0.2ml，1.8mmol/L CuSO4 0.4ml，500mg/ml酵母浸出汁0.2ml，0.2mol/L pH =6.2磷酸钠缓冲液0.6ml，加入不同量的试液(空白不加)，混匀，置发光仪中，于37℃加入60 mmol/L H2O2 0.6ml。启动反应，测定10s内发光强度的总值，每样品平行测定3次，取 平均值，按上式计算清除率。
3结果
3.1中药方剂对全血化学发光的影响
这4种中药方剂水提液都能抑制全血化学发 光，并且具量效关系(见表1)，但抑制能力大小不同，如果单从量效曲线回归方程所推出的 原液CI50(当抑制率为50%时，所需提取液用量的体积量)或固体量CI50(当抑制 率为50%时，所需水提液中固体量)来比较抑制能力的大小，由于缺乏比较的共同基础，往往 有些情况不好比较，为了便于统一比较，现以生物体内公认的抗氧化剂维生素C做为比较标 准，按下式计算中药方剂的抗氧化值AOV。
注：SL测=原液CI50×固体CI50；SL标=维生素C原液CI50×维生素C固体 CI50。
规定维生素C的AOV为零。当AOV＜0时，该中药方剂全血化学发光抑制能力大 于维生素C，反之亦然。与维生素C相比，正值越大，抑制能力就越小。从AOV值可以看出， 小建中汤抑制全血发光的能力相对最强，但这4种中药方剂在这个指标中的AOV值相差不大， 均有较强的抑制全血发光能力。
3.2中药方剂清除H2O2的作用
这4种中药方剂水提液对H2O2都 具有一定的清除作用，并且具有量效关系(见表2)。但清除能力大小不同，从中药方剂对H2O2的抗氧化值AOV来比较其抗氧化能力可以看出，小建中汤相对较强，八珍汤、十 全大补汤次之，一贯煎相对较弱。自从Allen［10］ 在1972年观察到吞噬细胞(PC)在呼吸爆发时出现发光现象以来，很多研究证实，这种发光现 象是由于PC在吞噬时出现呼吸爆发，产生多种活性氧物质，包括O÷2、H2O2、*OH 等，它们与细胞内某些可激发物质发生反应，产生化学发光。但这种发光十分微弱，若在细 胞吞噬的反应体系中加入发光增强剂鲁米诺，可使发光增强。随后Kato［11］建立的以全血为材料检测PC化学发光的方法中已证明了发光强度与细胞的吞噬氧化功能成 正比。而PC在吞噬时产生的活性氧是一类内源性毒物，是引起许多<
