关键词： 核心蛋白聚糖， 转化生长因子-β， A549细胞株， 溴化四唑蓝

摘要目的：从动物组织中提取纯化核心蛋白聚糖(Decor in)，检测其活性。方法：以大鼠肌肉为原料，采用匀浆、透析、层 析等步骤分离、纯化Decorin，经SDS-PAGE检测其分子量和纯度，并经细胞株A549检测生物 学活性结果：Decorin在SDS-PAGE显示分子量约为37～38 kD两条带 ，得率约为2 mg/g组织，对A549具有明显的抑制生长活性，抑制率＞50%。结论：此法获得的Decorin将有可能作为天然药物用于治疗肿瘤。

中图分类号Q513.03

Research and Development on Rat Skeletal Muscle Decorin

Chen Zhiyang Wang GuohuaCai YuboLiu XinpingYao Libo

（Department of Biochemistry， Fourth Military Medical University Xian 71 0032）

AbstractPurpose：The aim is to prepare and identify Decorin wh ich will be used to treat chronic inflammatory fibrosis and cancer.Method s:Decori n was extracted from rat muscle and purified by centrifugal,dialytic,chromatogra phic procedures.Results:About 37～38 kD stained band was observed on SDS-PAGE and it evidently inhibited cell growth in A549,inhibiting rate ＞50%. Conclusion:Decorin may have threapeutic effects against cancer.

Key wordsDecorin, TGF-β, A549 cell line, MTT

核心蛋白聚糖(Decorin)为蛋白多糖，含有一个核心蛋白和一个单链氨基多糖，含糖链和去 掉糖链后的核心蛋白两者均具有同样的生物学活性^［1］。美国Tellos制药公司，用D ecorin治疗因转化生长因子-β(TGF-β)过量表达所致的器官瘢痕，已进入Ⅰ期临床 ^［2］。近年来美国许多学者正在研究Decorin的抗肿瘤作用，研究资料表明，其抗肿瘤机 制为：激活表皮生长因子受体(EGFR),激活MAP信号传导通道，继而持续诱导P21抑瘤蛋白的 表 达^［3］。Decorin抗肿瘤的生物活性检测，是采用MTS/PMS颜料来了解A431细胞被抑 制程度^［4］。本文从动物组织中分离、纯化得到Decorin并初步检测到其对人肺癌上 皮细胞株(A549)生长有抑制作用。

1材料与方法

1.1材料及仪器

盐酸胍(CP)，上海试剂二厂；尿素(S_ABC)，华美生物工程公司；Triton X-100，天 津化学试剂厂；DEAE-cellulose，日本；RPMI-1640培养基，Gibco公司；溴化四唑蓝(MTT )，Sigma公司，用前配成1 mg/ml生理盐水母液；DMSO，华美生物工程公司；胎牛血清(FCS) ，杭州四季青生物工程公司；重组人表皮生长因子(rhEGF)，美国Promega公司。

CO₂孵 箱，西德；96孔培养板，美国；ELISA-reader MR 4000,日本；紫外分光光度计spectromet er lambda 14， Beckman公司。

1.2方法

1.2.1Decorin的分离、纯化^{［1，4，5］}取大鼠肌肉洗净，剪碎，匀浆(匀浆液：10 mmol Tris-HCl/0.5% Triton X-100 /10mmol/L EDTA-2 Na/50mmol/L NaAc， pH6.0)，离心，弃上清(主要含PG-L)，将沉淀分 两份，一份溶于沉淀溶解液 ① (4 mol/L 盐酸胍/10 mmol/L EDTA-2Na/10 mmol/L Tr is-HCl/ 50 mmol/L NaAc)，另一份溶于沉淀溶解液②(将沉淀溶解液①中4 mol/L盐酸胍换成4 mol/L 尿 素，余不变)。在电磁搅拌下促进溶解。然后依次对常水、dH₂O、PBS 4℃下透析。分别过 DE52-Cellulose柱，用含0.2～1.0 mol/L NaCl梯度洗脱，收集各峰。经SDS-PAGE鉴定， 得到Decorin①和Decorin②(以下简称D_①和D_②)，再进行生物活性检测。

1.2.2蛋白质含量测定用Lowry's法测定。

1.2.3SDS-PAGET=12%,C=6%,电压160V，ComR 250染色过夜。

1.2.4Decorin体外活性检测依文献［4,3］略加改进。将已长好的A549细胞，用消化液(0.25%胰蛋白酶-生理盐水)消化 ，计数，用10% Fcs-1640调细胞1×10⁵/ml，分于96孔板100 μl/孔，对照加生理盐水10 0 μl，实验分D_①、D_②、D_①或D_②+rhEGF、rhEGF4组，Decorin浓度200 μg/ml， rhEGF 100 ng/ml，37℃，5%CO₂孵育24 h，1 500 r/min离心15 min，加MTT 20 μl/ 孔，继续孵育4 h，小心吸弃上液100 μl，向每孔加DMSO 100 μl，轻轻摇匀后，在ELISA -reader MR 4000上用参比波长670 nm，测试波长570 nm，测定各孔A值。

2结果

2.1Decorin收率

每克大鼠肌肉组织约能得到Decorin 2 mg。

2.2SDS-PAGE

层析所获D_①和D_②在Marker 30～43 kD间有两条明显的主带，分子量约为37～38 kD ，在主带上下基本无杂带。过柱前除37～38 kD主带明显外，在主带上下67～94 kD、14.4～ 21 kD位置分别有3、5条细带(见图1)。

2.3Decorin对A549细胞抑制生长活性

复孔间差异＜30%(结果见图2、3)。

抑制肿瘤细胞增殖率=(A_对照-A_实验)/(A_对照)×100 %

结果表明，经盐酸胍提取的D_①和经尿素得到的D_②对肿瘤细胞生长抑制 率为45.30%～55.43%，当加入rhEGF其抑制率稍有增加，为58.12%～63.18%之间，但两组间( 单用Decorin和Decorin+rhEGF)对肿瘤细胞生长抑制无明显差异。

3讨论

Decorin是TGF-β的拮抗剂，能下调TGF-β所有的生物 学活性，由此，将其用来对抗TGF-β过量表达所致的纤维性慢性疾病^［6］。所建动 物模型经气管给药^［7］，这给今后的研究工作带来一定难度。随着研究的深入，Dec orin抗癌潜能得以发现，其抗癌作用也得到了进一步证实。

本实验结果表明，Decorin是针对EGFR高表达的癌细胞，另外，还发现其对胃癌7901 细胞株 也同样表现出抑制生长活性，提示抑癌活性是否还有其它的信号传导途径，有待进一步探明 。

目前，我们正在建抗癌动物模型，如果说体内也能得到预期的结果，鉴于Decorin是人体产 生的天然物质，和动物来源又具有很高的同源性，取材广泛，并可用基因工程生产，因此， 研制开发为一种抗肿瘤新药，其前景应该是乐观的。其次，我们还准备做抗纤维化动物模型 。肺纤维化、肝硬化等在临床日趋增多，用于治疗的生物制剂并不多见，Decorin作为一种 天然蛋白用于治疗慢性纤维化疾病应该有很大的潜能。

参考文献

1，王国华， 柴玉波，何鹏，等.核心蛋白聚糖的分离、纯化及活性鉴定.中国生化 药物杂志，1999，20(6)∶321～323

2，詹正嵩，徐琪寿，周勇，等.新药研究开发与应用.北京∶人民军医出版社，199 8∶140～142

3，Moscatello DK,Santra M,Mann DM,et al. Decorin suppresses tumor cel l growth by activity the EGF-R.J Clin Invest,1988,101(2)∶406～412

4，Santra M,Skorski T,Calabretta B,et al.De novo decorin gene express ion suppresses the malignant phenotype in human colon cancer cells.Proc Natl Aca d Sci,1995,92∶7016～7020

5，Brandan E,Inestrosa NC.Isolation of the heparan sulfate pGs from the E CM of rat skeletal muscle.J Neurobiol,1986,18(87)∶271～282

6，Border WA,Noble NA,Yamamoto T,et al. Natural inhibitor of TGF-β protects against scarring in experimental kidney disease.Nature,1992,360∶26

7，Giri SN,Hyde DM,Braun RK,et al.Antifibrotic effect of decorin in a bleomycin hamster model of lung fibrosis.Biochem Pharmacol,1997,54(1)∶1205～1 216

收稿日期1999-11-15

修回日期2000-04-03