关键词： 基因治疗，红细胞生成素，载体，调控

摘要：综述了红细胞生成素响应性贫血的基因治疗研究 现状，比较和评价了各种病毒和非病 毒性载体系统的临床前研究状况和优缺点，讨论了目前的研究热点和今后的研究方向。

中图分类号R973.3

Advances in Research on Gene Therapy of Erythropoietin Responsive Anemia

Diao YongWang Guangji Xu Ruian

（China Pharmaceutical UniversityNanjing 210009）

红细胞生成素（EPO）是治疗慢性肾衰、肿瘤及爱滋病等所致贫血的特效药物，病人须长期 甚至终身应用。而基因治疗，可以将EPO基因直接导入病人体内，长期产生具有治疗活 性的EPO。所以EPO基因治疗引起了人们浓厚的兴趣。目前已进行了大量的临床前研究， 为今后临床研究奠定了基础。

1EPO基因治疗研究发展史

从1994年首篇EPO基因治疗研究报道至今，已有30余篇相关论文发表。早期主要应用逆转录 病毒载体（RT）和腺病毒载体（Ad）进行基因转移，后期腺相关病毒载体（AAV）和非病毒 载体的应用日益增多。

EPO基因治疗的给药部位以肌肉为主，因为肌肉组织富含血管，数量多，更新慢，是分泌目 的蛋白的理想靶组织。也有人采用皮肤、腹腔和骨髓等作为给药部位。

EPO的体内表达必须受到严密的调控，过量表达会导致不良反应的发生，甚至出现致死性多 血症。最理想的调控方式当然是生理调控，但难以应用于工程细胞。自1997年开始EPO基因 治疗表达调控的研究以来，目前应用的人工调控系统主要有四环素、利福霉素、脱氧土霉素 (Dox)和米非司酮(Mif)调控系统等。

2EPO基因治疗的载体系统

2.1RT载体系统

最早有关EPO基因治疗的研究报道即采用了RT载体系统。 法国巴斯德研究所Heard等采用RT载体，进行了EPO基因治疗的系统研究。1995年，他们以编 码鼠EPOcDNA 的RT载体转染鼠原代皮肤成纤维细胞， 然后移植入小

鼠腹腔内。小鼠红细胞压积最高可升至80%，10个月内血清EPO 水平可达60～40 8 mu/ml^［1］ 。1996年，靶细胞改为鼠 成肌细胞，3个月内可见红细胞压积稳定增加^［2］。1997年之前的研究中动物致死性 多血症的 出现，迫使人们开展基因表达调控的研究。1997年，他们分别采用Tet^［3］和Dox ［4］调控系统，进行了动物体内EPO表达调控的研究。

RT载体由于仅感染分裂细胞，其治疗方式只能采用间接体内法（ex vivo），与宿主 基因 组的随机整合，理论上存在激活致癌基因和抑制抑癌基因的潜在危险性，因此其临床应用受 到了极大的限制。

Lenti 病毒载体是近年来开发的一种新型RT载体，其特点是能感染非分裂细胞。Barry等 ［5］应用该载体进行了EPO基因在大鼠体内的长期转基因研究。

2.2Ad载体系统

美国芝加哥大学Leiden等主要采用Ad载体进行了EPO基因治疗研究。1994年，他们构建了编 码hEPO的复制缺陷型Ad载体，新生小鼠和严重联合免疫缺陷（SCID） 成年小鼠肌注给药后，4个月内血清hEPO 浓度和红细胞压积显著升高，升高值与肌注剂量明 显相关^［6］。1997年他们首先在猴体内进行了EPO基因治疗，研究了Ad载体的安全性和 疗效^［7］。结果显示，2.5×10⁷～8 ×10⁷pfu/g（体重）的剂量是获得EPO长期 表达并形成多血症的阈值。猴单次肌注Ad载体，红细胞压积从40% 升高至70%，可稳定84 d 。X-光胸透、血清生化指标、血液、器官等未见异常。

与RT载体系统相比，Ad载体系统可以采用体内法（in vivo），应用方便；试验结果显 示疗 效与剂量存在相关性，可以通过调整剂量控制疗效；无潜在致癌作用。但Ad载体非常容易诱 发细胞免疫和体液免疫反应，决定了它不适为长期基因治疗的载体。虽然有报道认为外源转 基因蛋白是引起免疫反应的主要原因^［8］，但大多数研究仍认为是由病毒外壳蛋白 所致。1997年之后，Leiden等进行的 EPO基因治疗研究不再使用Ad载体，而改用裸 DNA。

2.3AAV载体系统

Kessler等^［9］首先应用AAV载体系统进行EPO基因治疗,获得初步成功。

自1997年起，法国巴斯德研究所Bohl等的研究重点也从RT载体系统转向AAV载体系统。他们 发现rAAV载体可有效转染有丝分裂后期肌纤维和成肌细胞，目的蛋白能长期在体内表达，表 达量与用药剂量成正比^［10］。他们还研究了转染骨骼肌细胞后rAAV载体结构的变化 情况,认 为结构呈多连体或交互环状的高分子量DNA的形成是建立EPO稳定高表达状态的关键^{［11 ］}。他 们还采用单AAV载体和双AAV载体系统进行了EPO的表达调控研究,分别可在18和29周内控制 EPO的表达^{［12，13］}。

Ye等^［14］采用AAV载体，在猴体内进行了EPO基因治疗的研究。他们采用双载体rapa mycin调控系统，在3个月内能够在猴体内有效调控EPO的表达。

重组AAV载体具有以下优点：仅保留了必要的顺式作用元件，不编码病毒蛋白，免疫原性小 ；不含病毒转录控制元件，不会干扰目的基因或调控基因的表达；可直接体内应用；载体DN A与宿主染色体定向整合，可实现长期表达；无致癌危险性；近年来高纯度、高滴度、无野 生病毒和辅助病毒污染的rAAV病毒载体制备技术的改进^［15］，为其临床应用创造了 条件。During等^［16,17］发明的口服AAV载体，为减轻病人痛苦，方便用药提供了新 途径。因而AAV载体越来越受到人们的关注，其应用呈上升趋势。

AAV载体的包装容量小（＜5kb），限制了其应用。但最近关于AAV载体分子间环型连环化机 理的研究，提示可以通过反式拼接，增加其包装容量。Yan等^［18］将EPO 基因组的5 ′和3′ 端分别重组入两个不同的AAV载体，可以实现完整EPO蛋白在小鼠体内的长期表达，证明了AA V载体的反式拼接作用。

2.4非病毒载体系统

基因治疗最初研究是采用非病毒载体系统，但由于组织摄取和体内表达效率低，用药剂量 太大等缺点，人们倾向于开发病毒载体系统。然而早期病毒载体系统如RT和Ad载体的种种严 重缺陷限制了其临床应用。而非病毒载体系统因具有易构建、容量大、易纯化、无严重免疫 反应、可重复给药、量效关系明显等优点，重新受到青睐。如一直使用Ad载体的 Leiden等 ，于1997年开始使用裸 DNA，至少在90 d内可以获得mEPO的稳定表达^［19］。1999年 他们改用基因枪技术，研究了皮肤转基因的可能性^［20］。虽然转染长寿命细胞如肌 肉细胞是多数基因治疗项目的目标，但由于能满足宿主生理需要的调控手段暂时无法建立 ，一旦出现严重不良反应时，只好通过手术将转染细胞从肌肉组织取出。而皮肤细胞属于短 寿命细胞，易于接近，可以通过控制给药剂量和用药周期控制疗效和不良反应。另外，法国 Aebischer 等^［21］将质粒有效转染靶细胞后，采用高分子材料包裹，然后移植入动 物体内，也取得了一定的成功。

3EPO基因治疗的调控

基因治疗最理想的调控方式当然是生理调控，Rinsch等^［22］开发了一种根据生理状 态调节hEPO分泌的工程细胞系。hEPO 的表达受低氧响应启动子控制，体内外实验均获得了 一定的成功。Shibata等^［23］也对低氧响应选择性基因表达进行了研究 。

由于技术原因，生理调控系统暂时还难以应用。目前应用较多的还是人工调控系统。优良的 调控系统应该具备以下特性：基础表达低；诱导率高；口服药物正调控；诱导状态可逆等。

1997年，Bohl 等进行了双RT载体系统动物体内EPO表达调控的研究。由于RT载体系统的缺陷 ，他们又于1998年开展了rAAV载体系统的表达调控研究。Rendahl采用双rAAV载体系统，四 环素为诱导物。Bohl采用单rAAV载体系统，Dox为诱导物。两者都达到了长期调控EPO表达的 目的，与RT载体相比，操作方便，更适合临床试验要求。但这些调控系统所使用的嵌合转录 因子的免疫原性仍需要进一步研究。

Ye等^［14］采用利福平调控系统，其优点在于：基础表达几乎为零；诱导作用强且可 逆。但嵌合转录因子的免疫原性仍未得到解决。

4免疫隔离系统在EPO基因治疗的应用

将能分泌活性蛋白的工程细胞经半透膜包裹后，形成一免疫隔离系统，然后移植入体内的方 法引起研究人员的浓厚兴趣。营养物质可以渗透入系统内，维持工程细胞正常功能，活性蛋 白也可以释放至循环系统，而宿主免疫反应介质由于具有较大分子量而被挡在系统之外，避 免了免疫反应的发生。该方法具有以下优点:不改变宿主基因组，增加了安全性;在移植前可 有大量的样品用于质量评价;容易采用现有调控系统对基因表达进行调控;万一发生严重不良 反应，可以通过简单的手术将系统取出。

1999年，Heard等^［24］将编码EPO的RT载体，在体外感染NIH3T3细