摘 要 CYP2C9是人类肝脏中含量丰富的一种CYP450酶，它能代谢和/或活化许多种药物、前致癌物、前毒物和致突变剂。CYP2C9基因具有遗传多态性，在人类存在几种等位基因的突变体。本文从基因结构、底物和探针药、影响其活性的因素、遗传多态性的分子机制等方面综述CYP2C9的研究进展。

Recent Advance of Cytochrome P450 2C9

LU Ai-Hua,SHU Yan,ZHOU Hong-Hao

(Pharmacogenetic Research Institute, Hunan Medical University, Changsha 410078)

Abstract As an abundant CYP450 form in human liver, CYP2C9 can metabolize and/or activate a large variety of drugs, pre-carcinogens, pre-toxins and mutagens. CYP2C9 gene has several mutant alleles leading to genetic polymorphisms in humans. In the present article, the CYP2C9 gene structure, the underlying molecular mechanisms for its genetic polymorphisms, the substrates and probe drugs toward CYP2C9, and factors affecting its enzyme activity are reviewed.

Key words CYP2C9; drug metabolism; genetic polymorphism; gene mutation; pharmacogenetics

CYP450（cytochrome P450）是一组涉及到许多内、外源性物质代谢的单加氧酶，位于细胞内质网膜上。 CYP450蛋白由CYP基因超家族编码，在哺乳动物中这个基因超家族至少含有10个家族，而最大的CYP2家族在人类又可分成6个亚家族，编号为A-F，其中CYP2C基因定位在染色体10q24.2。迄今为止，已分离出六个CYP2C的cDNAs，即CYP2C8、CYP2C9、CYP2C10、CYP2C17、CYP2C18及CYP2C19^[1]，其中CYP2C9基因编码的蛋白在人肝微粒体中含量丰富，约占CYP450s总量的20％，仅次于CYP3A。CYP2C9能代谢许多不同性质的药物，并在前致癌物、前毒物和致突变剂的活化中也起一定作用。大量研究表明，CYP2C9具有遗传多态性^[2～4]，它在人类存在几种等位基因的突变体，其中研究最多、也是最主要的有三种，即野生型 (CYP2C9*1)、R144C突变体(CYP2C9*2)和I359L突变体(CYP2C9*3)^[2]。CYP2C9作为药物代谢中一种重要的CYP450酶，它的结构、功能特点及其在物质代谢中的作用已得到广泛研究。

1. CYP2C9的分离纯化、分布及其cDNA的克隆^[5]

CYP2C家族的成员已在不同的实验室得到纯化，1983年Wang等人从人肝微粒体分离纯化了一种命名为P4508的蛋白，后Umbenhauer等人(1987)证实这种P4508即为CYP2C9，其分子量为53KDa，在兔与其相应的蛋白质命名为CYP2C11，二者具有85％以上的同源性。在底物特异性方面，CYP2C9曾被认为是S-美芬妥英(S-mephenytoin, S-MP), CYP2C19的特异性底物4'-羟化酶。但进一步的研究表明，尽管重组的CYP2C9 Ile359酶具有S-MP 4'-羟化酶活性，但活性很低；并且对人CYP2C9的PCR产物进行序列分析也显示，各种CYP2C9等位基因突变体的S-MP 4'-羟化酶活性无明显差异。现认为甲苯磺丁脲和苯妥因的羟化代谢由CYP2C9特异性介导。CYP2C9蛋白主要分布于肝脏，在小肠也有少量分布，但其浓度仅为肝脏中的1/200，而食道、胃和肾中未见CYP2C9的分布，在胚胎肝中检测不到CYP2C9的活性。CYP2C9及其各种等位基因突变体的cDNAs已得到克隆。Umbenhauer等人在1987年首先从人肝组织cDNA文库中分离出CYP2C9的cDNA，同时另一个与CYP2C9在编码区仅有两个氨基酸差异但在3'-非编码区与之有较大差别的cDNA由Ged等人(1988)分离，并命名为CYP2C10。CYP2C10与CYP2C9的结构和功能相似，因此二者常以CYP2C9110表示。CYP2C9各种等位基因的cDNAs克隆能在不同生物系统中得到表达，包括酵母、COS细胞、HepG2型细胞、杆状病毒、昆虫和大肠杆菌等，这为体外研究CYP2C9生化及其分子生物学特性提供了便利。

2.CYP2C9的基因结构及上游调控区域

1993国外从一个S-MP强代谢者(extensive metabolizer, EM)个体分离出CYP2C9基因，并发现CYP2C9基因含有9个外显子和8个内显子，全长约为55kb。人CYP2C9基因比兔和鼠相应的基因要大得多，其内含子、外显子连接处的结构与其它CYP2C9基因相似。在CYP2C95'-上游2.2kb以内含有几个与糖皮质激素效应元件(GRE)一致的序列，这种序列在CYP2C8和CYP2C18中也存在，同时在巨型杆菌中负责糖皮质激素或苯巴比妥诱导表达P450BM-3的保守序列（含15个碱基）也出现在CYP2C9基因的5'-上游区域，这一序列也存在受苯巴比妥诱导的基因如CYP2B1和CYP2B2的5'-上游，因此CYP2C9有可能被糖皮质激素和苯巴比妥诱导。另外，在CYP2C9起始密码子上游57bp和110bp处分别有一个TATA和CAAT盒子，在150bp处CYP2C9增强子区域含有一个与HepG 2特异因子1(HPF-1)一致的结构域 (motif)，该结构域与HNF-4的特征性序列相似，后者为兔CYP2C基因在HepG 2细胞表达所必需，而在COS-1细胞中表达则不需要。此外，该结构域在CYP2A、CYP2C和CYP2D中普遍存在，对肝脏中这些CYP的特异性表达具有重要作用。CYP2C9上游调控区域还含有肝脏所富有的转录因子如C/EBP和AP-1等，这些结构共同参与CYP2C9基因的表达调控。

3.CYP2C9的底物结合位点

底物与CYP450s活性位点的结合主要依赖于疏水性基团的相互作用，但其它结合方式可赋于酶作用的区域性和立体选择性等特点。如CYP2D6是代谢药物的一种主要酶类，底物与其活性位点的结合依赖于离子对(ion-pair)的相互作用；而对CYP2C9而言，尽管其代谢的底物性质各异，但这些底物均有提供或接受氢键的能力^[6]。几乎所有CYP2C9的底物均为极性酸性物质，因此在生理性的pH环境中，这些底物主要以阴离子状态存在。根据以上特点，Mancy 等人(1995) 运用分子模型对CYP2C9的底物结合位点进行了描述：底物通过它们的阴离子位点A-与CYP2C9蛋白C+的阳离子残基相互作用，底物羟化位点(Hy)与阴离子位点A-的距离为7.8±1.6A，而该两点连线与CYP2C9蛋白的阳离子位点C+组成的角为82±150，这种模型对于说明CYP2C9的作用方式有一定的指导作用。

4.影响CYP2C9活性的因素

CYP2C9的表达无性别、年龄差异，饮食、健康状况和长期饮酒有可能影响其活性。CYP2C9蛋白含有一个能被细胞色素b5识别并对其产生激活作用的位点，即Arg-Arg-Phe-Ser，这个位点经cAMP依赖性激酶进行氨基酸残基Ser磷酸化修饰后能被细胞色素b5识别，进而导致对该酶的激活，当Ser被Cys代替时，如CYP2C18，则细胞色素b5失去对该酶的激活作用。CYP2C9能代谢许多药物，但同时又有许多药物影响其活性的表达。目前已知^[7]，能够诱导CYP2C9活性表达的药物有卡马西平、苯巴比妥和利福平等，而能抑制其活性的物质有磺胺、安替比林、双香豆素、氯霉素、西米替丁、保泰松、苯磺唑酮、唑类抗真菌药(如氟康唑、酮康唑、麦康唑)和选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRIs)等，另外噻吩利尿酸作为CYP2C9的自杀型底物，也可引起CYP2C9的失活。CYP2C9等位基因的突变体(R144C和I359L)在不同生物系统中表达时，其相应的酶蛋白活性均低于野生型。阐明影响CYP2C9活性的因素对于认识临床上药物-药物相互作用的机制具有重要价值。

5.CYP2C9遗传多态性的分子机制

早在1979年，Scott等人^[8～9]就发现甲苯磺丁脲的甲基羟化代谢在人群中存在一定的多态性，尽管后来Veronese等人(1993)在106名健康白人中未发现甲苯磺丁脲羟化代谢的两态分布，但更多的研究均表明甲苯磺丁脲和苯妥英的羟化代谢确实具有多态性特点，现认为其根本原因在于CYP2C9具有遗传多态性。大量研究表明，CYP2C9在人类存在几种等位基因突变体^[2]，其中最主要的有三种，即野生型(CYP2C9*1)、R144C突变体(CYP2C9*2)和I359L突变体(CYP2C9*3)，并已在不同的种族得到证实。根据Hardy-Weinberg准则，甲苯磺丁脲和苯妥英羟化代谢的PM发生频率在白人为0.2%^[10]。为探明CYP2C9遗传多态性的分子机制，Wang等人(1996)利用PCR-核酸内切酶消化法检测CYP2C9 cDNA中的点突变，结果显示：CYP2C9共有4个点突变，第一个突变为第3外显子C416→T，造成氨基酸发生Arg144→Cys改变，导致该处的一个Ava II位点丢失；第二个突变为第7外显子A1059→G (Cys358→Tyr)；第三个突变也出现在第7外显子，由C1061替代A，相应氨基酸发生Ile359→Leu的改变，这两个突变均可导致一个Nsi I位点的丢失；第四个突变为第8外显子A1236→G，引起氨基酸残基Gly417替代Asp417，导致一个Hph I位点的丢失。研究表明: Arg144/Tyr358/Ile359/Gly417为CYP2C9的主要等位基因，常表示为野生型(CYP2C9*1)。因Tyr358/Gly417在不同实验室所有的个体中几乎均表现为纯合子，说明这两个等位基因不太可能代表CYP2C9的遗传多态性。第一和第三个点突变，分别表示为R144C(CYP2C9*2)和I359L(CYP2C9*3)，它们在人群中具有一定的发生频率并具有种族差异，其中白人稍高于亚洲人（表1）^[4,11～13]。这两种突变体的cDNA在不同的重组表达系统中表达时，I359L(CYP2C9*3)突变可显著降低甲苯磺丁脲和苯妥英的代谢率。Takanashi等在体外观察了I359L(CYP2C9*3)突变对CYP2C9的七种底物的代谢动力学特征的影响，发现CYP2C9的代谢活性均显著降低，降低程度因药物而异^[14]。人体内试验表明，CYP2C9*3纯合子个体的药物清除率显著低于CYP2C9*1纯合子个体^[15]。但是，R144C (CYP2C9*2) 对CYP2C9酶活性的影响相对较小^[3,9]。

比较144和359位氨基酸残基的功能发现^[16]