摘要 为了观察对苯丙氨基苯乙酸（BPAA）对喹诺酮类药物与人γ－氨基丁酸A（GABA_A）受体的相互作用，本研究首次用重组人类GABA_A受体，通过放射配体结合竞争抑制实验方法，依次进行了联苯丁酮酸、BPAA对萘啶酸类喹诺酮抗菌药依诺沙星（enoxaxine）竞争抑制³H-蝇蕈醇与Sf-9膜表达GABA_A受体亚型A₂β₂γ₂s、A₂β₃γ₂s、α₂β₃γ₂s、α₃β₃γ₂s和α₅β₃γ₂s结合的实验。结果发现BPAA能明显增加依诺沙星对³H-蝇蕈醇与各受体亚型的竞争抑制作用，IC₅₀减小10⁴~10⁵倍，与BPAA相比，联苯丁酮酸的抑制作用较小，IC₅₀减小10²倍。本研究直接反映了联苯丁酮酸和BPAA与喹诺酮类药物在体内与GABA_A受体的相互作用，其作用机制可能是两种药物发生了化学/分子作用，形成一种与GABA_A受体有着极高亲和力的新结构。目前，本研究还在继续进行，验证喹诺酮类药物和BPAA之间的这种化学/分子作用。

The interaction of quinolones and 4-biphenylacetic Acid

with GABA_A receptor

SI Tian-mei, SHU Liang

(Institute of Mental Health, Beijing Medical University, Beijing 100083)

Mogens Nielsen

(Institute of Biologic Psychiatry, St. Hans Hospital, Roskilde, 4000, Denmark)

Abstract The co-administration of non-steroidal anti-inflammatory drug fenbufen increases the risk of epileptogenicity of quinolones significantly. In vitro 4-biphenylacetic acid, an active metabolite of fenbufen, has been found to have the ability to increase the inhibation of quinolones on the binding of ³H-muscimol or ³H-GABA and the GABA_A receptor in the animal brain tissue. In the present study, we observed the influence of fenbufen, BPAA on the competitive inhibatory effects of enoxacine, a new sructure of quinolones, on the binding of ³H-muscimol and the Sf-9 membrane expression GABA_A receptor subtypes of human brain: A₂β₂γ₂s、A₂β₃γ₂s、α₂β₃γ₂s、α₃β₃γ₂s和α₅β₃γ₂s, with the radio ligand binding assay (RLBA). Results showed that BPAA significantly increases the competitive inhibitory effect of enoxacine on the binding of ³H-muscimol and GABA_A receptor subtypes. The value of IC₅₀ increases by 0⁴-10⁵. Fenbufen only affect mildly the binding of ³H-muscimol and GABA_A receptor subtypes. There is a parallel shift of the dose-response curve of the ligand to left. Present study suggests that there may be an internal molecular/chemistry interaction between quinolones and BPAA, producing a new structure which has a high affinity on the GABA_A receptor sites. The research is going on to test the internal chemistry/molecular interaction between quinolones and BPAA.

Key words fenbufen; 4-biphenylacetic Acid(BPAA); quinolones;γ-aminobutyric acid(GABA)

喹诺酮类药物是一族应用广泛的广谱抗菌素，伴有轻微的神经性药物不良反应，如：头痛、眩晕、恶心、呕吐（发生率为1_~4%），严重者可出现癫痫发作。非甾体类消炎药联苯丁酮酸与喹诺酮类药物联合应用能明显增加喹诺酮类药物的致癫痫危险性。药理研究发现喹诺酮类药物,如环丙沙星、依诺沙星和诺氟沙星等能够抑制啮齿类动物大脑突触后放射配体与GABA_A受体的结合，联苯丁酮酸的活性代谢产物-对苯丙氨基苯乙酸(化学结构式见图1,以下简称BPAA)能增强喹诺酮类药物对³H-蝇蕈醇和³H-GABA与GABA_A受体结合的抑制作用(10³倍以上)⁽¹⁾。为进一步了解喹诺酮和BPAA与GABA_A受体之间的相互作用，本研究观察了BPAA对萘啶酸类喹诺酮抗菌药依诺沙星（enoxacine）与人类重组GABA_A受体亲和性的影响。

Fig1. Chemical Structure of BPAA

材料和方法

依诺沙星、BPAA、联苯丁酮酸和³H-蝇蕈醇(20Ci/mmol)从Sigma公司购进。GABA_A受体为重组人类GABA_A受体亚型-A₂β₂γ₂s、A₂β₃γ₂s、α₂β₃γ₂s、α₃β₃γ₂s和α₅β₃γ₂s。Opti-Flour闪烁液，Tris-Citrate缓冲液(pH=7.1, 50mmol·L^-1)。

真空抽滤泵，WhatmanGF/C玻璃纤维滤膜， Wallac1409液闪计数仪。

1.人类重组GABA_A受体亚型

重组过程为经典的昆虫杆状病毒方法^(2，3)。首先构建人类各种GABA_A受体亚单位cDNA表达质粒(pBlueBacII)，转染至昆虫杆状病毒内，传染Sf-9昆虫细胞，经培养，分离，纯化，活性测定等，得到具有GABA_A受体生理和药理作用的Sf-9细胞膜表达GABA_A受体亚型，置于-80℃备用。

2. 放射配体竞争抑制结合测定（Radio Ligand Binding Assay, RLBA）

2.1 联苯丁酮酸对依诺沙星竞争抑制³H-蝇蕈醇与膜表达A₂β₂γ₂s 结合的影响

膜表达A₂β₂γ_2S细胞，室温解冻，加10mL冰Tris-Citrate缓冲液离心，（15,000rpm·min^-1,共10min)，弃上清，加1.5ml缓冲液于37℃孵育30min，重复洗两次，

进行反应。终反应体积0.5ml(蛋白浓度0.117g·L^-1)，加³H-蝇蕈醇（10nmol·L^-1）25μl。设三组反应，一组依诺沙星系列浓度(10^-3-10^-9molmol·L^-1)各25μl，第二组为联苯丁酮酸系列浓度(10^-3_～10^-6molmol·L^-1)25μl，第三组为25μl系列浓度依诺沙星(10^-3-10^-9mol.L^-1)和25μl联苯丁酮酸(10^-4molmol·L^-1)，前后空白加25μlGABA(10^-4molmol·L^-1，100％竞争抑制)，对照（总结合）为25ul溶剂(95%乙醇＋0,1 mol·μL^-1 HCL)。反应30min，加5ml冰Tris-Citrate缓冲液，并立即用玻璃纤维滤膜真空抽滤，再以10ml冰缓冲液冲洗，将滤膜转移至计数瓶内，加入3ml闪烁液，置于液闪计数仪测定放射活性，以24h的计数结果为准。

2.2 BPAA对依诺沙星与A₂β₂γ_2S、A₂β₃γ_2S、α₂β₃γ_2S、α₃β₃γ_2S和α₅β₃γ_2S结合的影响

将膜表达GABA_A受体A₂β₂γ_2S、A₂β₃γ_2S、α₂β₃γ_2S、α₃β₃γ_2S和α₅β₃γ_2S室温解冻，分别进行实验，具体操作方法同上。

2.3 计算IC₅₀ (用Excel97和Origin5.0作图软件)

Y=Bound(%)=RatioRadioactivity=(dpm(药物)-dpm(空白))/(dpm(对照)-dpm(空白))×100%，X=Log(药物浓度)(mol·L^-1)，以Y对X作图，计算计算IC₅₀(抑制结合半量时配体或药物浓度，反应配体受体的亲和性)和Hill系数（反映受体与配基结合作用中协同性的程度。Hill＝1，表明没有协同性，Hill＞1，为正协同，Hill＜1，或者是负协同，或表示存在不同亲和力的结合部位）。Y=1.0，为药物与受体无任何结合，完全为³H-蝇蕈醇结合；Y=0，药物完全抑制³H-蝇蕈醇结合。以Y对X作图，观察药物剂量-反应曲线的变化。

结果

1.联苯丁酮酸对依诺沙星与³H-蝇蕈醇竞争结合Sf-9细胞膜表达GABA_A受体亚型A₂β