目的观察蛋白激酶A（PKA）及蛋白激酶C（PKC）抑制剂和蛋白脱磷酸化物质对大鼠心室肌细胞ATP敏感性钾电流（I_KATP）的影响，探讨克罗卡林（cromakalim）开放ATP敏感性钾通道的作用机制。方法 采用全细胞膜片钳技术记录心室肌细胞I_KATP。结果在37 ℃时克罗卡林（1 μmol·L^-1）可阻断ATP的抑制作用，诱导出I_KATP。PKA抑制剂PKI(6～22)amide （1 μmol·L^-1）,可模拟克罗卡林的作用，激活I_KATP；而PKC抑制剂calphostic C无此作用。同时还观察到蛋白脱磷酸化物质butanedioe monoxime (BDM,5 mmol·L^-1)也可诱发出IKATP。结论克罗卡林开放I_KATP机制与抑制PKA的活性有关，而与PKC无关。

中图分类号R966

Research of relationship between protein kinase

and ATP-sensitive potassium current

ZHAO Ming-Gao

(Department of Pharmacology, The Fourth Military Medical University, Xi′an 710032)

ZHAO De-Hua

(Department of Pharmacology, The Fourth Military Medical University, Xi′an 710032)

ZHANG Yan-Feng

(Analysis and Test Center, The Fourth Military Medical University, Xi′an 710032)

XIONG Xiao-Yun

(Department of Pharmacology, The Fourth Military Medical University, Xi′an 710032)

YAO Xiu-Juan

(Department of Pharmacology, The Fourth Military Medical University, Xi′an 710032)

AimTo observe the effects of protein kinase A (PKA),protein kinase C(PKC) inhibitor and dephosphorylating agent on ATP-sensitive potassium current(I_KATP) of rat ventricular cardiomyocytes and investigate the mechanism of cromakalim opening I_KATP. MethodsWhole-cell patch-clamp was used to record I_KATP. ResultsCromakalim (1 μmol·L^-1) was shown to induce I_KATP at the holding potential of －10 mV, 37 ℃. When added to the pipette solution, the PKA inhibitor PKI(6～22)amide (1 μmol·L^-1) caused production of I_KATP, just as cromakalim did, while the PKC inhibitor calphostic C(1 μmol·L^-1) showed no effect. Moreover, addition of the dephosphorylating agent, butanedione monoxime (5 mmol·L^-1),to the bath also stimulated I^KATP. ConclusionThe mechanism of cromakalim opening I^KATP is due to the inhibition of PKA (not PKC).

Key wordscromakalim; ATP-sensitire potassium current(I^KATP); protein kinase A； protein kinase C

钾通道开放剂如克罗卡林和pinacidil，具有激活心肌和平滑肌等组织ATP敏感性钾通道的作用^[1,2]，目前已用于治疗高血压和抗心肌缺血。现已知，ATP敏感性钾电流（IKATP）可被细胞内ATP所抑制，因而在生理条件下此通道不开放，但在缺血、代谢障碍及钾通道开放剂存在时，IKATP开放^[3]。目前，IKATP开放机理仍不完全明了，但IKATP通道蛋白的磷酸化状态与通道开放具有十分密切的关系^[4]。本实验采用全细胞膜片钳技术，观察PKA抑制剂PKI(6～22)amide、PKC抑制剂calphostic C和化学性磷酸酶butanedione monoxime（BDM）对IKATP的影响，探讨IKATP与蛋白激酶之间的关系。

1材料与方法

1.1心室肌细胞制备Sprague-Dawley大鼠，体重150～182 g，由第四军医大学实验动物中心提供（陕动字第003号）,♀♂兼用。戊巴比妥钠30 mg·kg^－1腹腔麻醉，迅速摘取心脏，Langendorff法离体心脏灌流。0.1％胶原酶（I型，Sigma）消化分离大鼠心室肌细胞^[5]。

1.2仪器及药品膜片钳放大器(CEZ-2300,日本光电公司);电刺激器(SEN-7103, 日本光电公司)； 步脉冲发生器(8-8300,日本光电公司);示波器(CS- 8010,键伍公司);数字磁带记录仪(MR-10,TEAC公司)。PSS组成（mmol·L^－1）:NaCl 125, KCl 4.8, MgCl2 3.7, KH₂PO₄ 1.2, HEPES 10, EGTA 1.0, glucose 11; NaOH调整 pH为7.3，100％O₂饱和。电极液组成：NaCl 5, KCl 120, MgCl₂ 1.2, KH₂PO₄ 1.2, HEPES 10, EGTA 1.2, glucose 11, sodium pyruvate 2; KOH 调整pH为7.3 。克罗卡林，glibenclamide 和calphostic C(Sigma)于实验前临时溶解于DMSO中。实验中PSS液以1 ml·min^－1恒速灌流，克罗卡林终浓度为1 μmol·L^－1，glibenclamide为1 μmol·L^－1， BDM（Sigma）为5 mmol·L^－1。电极液中PKI(6～22)amide（Sigma） 终浓度为1 μmol·L^－1，calphostic C为1 μmol·L^－1。温度控制于37 ℃。

1.3实验方法采用全细胞膜片钳记录心室肌细胞钾电流，以Ag-AgCl电极引导致膜片钳放大器，电极电阻4～5MΩ，钳制电压－10 mV , 刺激时程300 ms。实验电压分别为0 mV、＋20 mV、＋40 mV。结果记录于多道数字磁带记录仪，记忆示波器回放，各实验电压下诱发电流的峰值作为该电压下的电流值。

1.4统计学处理数据以±s表示，采用t检验。

2结果

实验分离的心室肌细胞有70％呈柱状，细胞边界与横纹清晰，静息电位－(72±10) mV。

2.1蛋白激酶抑制剂对IKATP的影响在37 ℃ 时，各实验电压下均可记录到一外向性电流，并可被glibenclamide抑制，此电流主要为IKATP。在同等实验条件下，在电极内液中加入PKA抑制剂PKI(6～22)amide（1 μmol·L^－1）可诱发出IKATP（图1）。而PKC抑制剂calphostic C（1 μmol·L^－1）未诱发出IKATP（图2）。

图1PKI(6～22)amide对大鼠心室肌IKATP的作用

钳制电压为－10 mV，实验电压分别为0，＋20，＋40 mV(n=4),与正常对照比较*P＜0.01

图2calphostic C对大鼠心室肌IKATP的作用

钳制电压为－10 mV，实验电压分别为0，＋20，＋40 mV(n=3),与正常对照比较*P＜0.01

2.2化学磷酸酶BDM的作用在PSS液加入磷酸化酶，使蛋白质脱磷酸化的物质BDM（5 mmol·L－1），亦可诱发出IKATP，电流稍小（图3）。

图3BDM对大鼠心室肌I_KATP的作用

钳制电压为－10 mV，实验电压分别为0，＋20，＋40 mV(n=4),与正常对照比较*P＜0.01

3讨论

通道的本质是蛋白质，因而多种修饰蛋白质的因素可以调节通道活性，例如pH，细胞内氧化还原状态，酶活性修饰以及阻断剂等。这些调节因素有的是对通道直接作用，有些则是通过改变细胞内信号传导而间接发挥作用。通道蛋白质磷酸化与脱磷酸化过程为通道调节的重要机制之一，如乙酰胆碱N型受体、GABA A受体、谷氨酸受体、钙通道、及氯通道等^[4]。细胞内的第二信使如Ca^2＋、 cAMP、GTP等均可影响I_KATP的开放。有报道认为^[6]，I_KATP通道蛋白三个位点上苏氨酸残基的磷酸化与否，决定该通道的功能状态。因此，蛋白激酶在K_ATP开放中可能具有重要的意义。

PKA抑制剂PKI(6～22)amide可模拟克罗卡林的作用，激活I_KATP，PKC抑制剂calphostic C无此作用，因此PKC与I_KATP开放过程无关。蛋白脱磷酸化物质BDM，也可诱发出I_KATP，可见，通道蛋白脱磷酸化可导致I_KATP开放。

结果提示，克罗卡林开放I_KATP机制，可能与抑制PKA活性有关,而与PKC无关。

国家自然科学基金资助项目 №39500177

招明高，男，30岁，博士研究生，讲师。

赵德化，男，64岁，教授，博士生导师。

参考文献