摘要氨基糖苷类抗生素因其独特的药理特点目前在临床上仍然是治疗革兰氏阴性菌感染不可缺少的药物；但由于在长期使用中出现的耳、肾毒性和耐药现象的增加，故有必要继续研制出耳、肾毒性低，且对耐药菌有较好作用的氨基糖苷类新抗生素。本文论述了采用遗传学途径原理有目的地筛选阻断型突变株，将新抗生素筛选的思路和鉴别手段与抗生素的菌种选育相结合，以此思路和方法筛选获得了多个新抗生素产生菌，如小诺霉素、西索米星。特别是采用这一新方法成功地筛选得到产生庆大霉素C_1a单组份的阻断株，然后以该单组份抗生素为母核通过模仿(me-too)方法对该母核进行化学修饰最终成功地开发拥有独立自主知识产权的高效、低毒、抗耐药菌的国家级一类新药——硫酸依替米星。该新思路和方法在目前仍不失为研究和开发新药的一条捷径。

Idea of screening new aminoglycosides antibiotics and developing of etimicin

Zhao Min，Fan Jin

(Jiangsu Institute of Microbiology，Wuxi 214063)

氨基糖苷类抗生素具有水溶性好，性质稳定，抗菌谱广，抗菌杀菌能力强，吸收排泄良好，与β-内酰胺类联合有协同作用等特点，自问世以来一直是临床上重要的抗感染药物，尤其是作为治疗革兰氏阴性菌感染和结核病不可缺少的药物。由于此类抗生素存在不同程度的耳、肾毒副作用，以及长期使用所出现的耐药情况，使人们不断致力于研制一些对钝化酶稳定，对产酶菌、耐药菌具良好抗菌作用，且耳、肾毒性较低的氨基糖苷类新品种。

氨基糖苷类抗生素的早期筛选系立足于从土壤微生物代谢物中寻找，以后又以它们为母核进行化学结构改造、生物转化及突变生物合成以得到新化合物。

自1944年由美国瓦克斯曼发现第一个氨基糖苷类抗生素—链霉素以来，氨基糖苷类抗生素的发展已经历了半个多世纪。我国自建国以来，在氨基糖苷类抗生素领域的研究中也取得了令人瞩目的成绩。一些国际上常用的品种，如：庆大霉素(gentamicin，GM)，阿米卡星(amikacin，AMK)，妥布霉素(tobramycin，TOB)，小诺霉素(micronomicin，MCR)，奈替米星(netilmicin，NTL)等我国均能生产，但应该指出这些品种均是仿制产品，这主要是由于创新药物研究的难度大以及我国的新药研制资金投入太少所致。自20世纪80年代起，随着我国经济上的改革开放，人们越来越意识到药品研制的知识产权问题的重要性。中国经济的国际化进程加快，已有越来越多国外学者和厂商进军中国的医药市场，并在中国申请新药的行政保护或专利。然而长期跟着别人的步伐走，已使我国的新药创新水平远远落后于国外，作为药物研究者更感到责任的重大。为了高效、有目的的筛选和研究具有自主知识产权的新药，我们深感在学习前人的有益经验和思路时，还应当结合自己的优势和特长，走自我发展的新路。为了支持和促进创新药物的研究，我国于1987年设立了新药研究基金，在1987年～1997年十年间，该基金共资助了382项新药研究项目，其中四项获得了国家一类新药证书，而半合成氨基糖苷类新抗生素—依替米星(etimicin；ETM，又名抗生素89-07)是唯一获一类新药证书的抗感染药物。作为依替米星的发明者，回顾十年来的研究历程，感到很值得回味，愿以自己的体会和思想与同行们切磋交流。

1寻找新抗生素的新思路和方法

众所周知，常规菌种选育方法(见筛选流程A)是以筛选高效价的突变株为目标。以庆大霉素为例，长期以来选育工作着力于庆大霉素发酵效价提高，而忽略了其菌种代谢产物的组份研究，致使自认为优质、高效价的庆大霉素成品出口遭国外退货的事件出现。为此我国自20世纪70年代起就专门组织了庆大霉素组份的研究，经研究证实，GM是一个多组份的抗生素，主要由GMC₁、GMC₂、GMC_1a三个组份组成，它们的毒性和抗菌活力均有一定的差异，因此复合物中各组份的相对含量的变化关系着产品的疗效和毒副作用，并且影响到产品的质量。为此，1985版中国药典即对GM的三个主要组份的相对含量作了规定，因而我们在进行GM菌种选育时，设计了以效价结合组份考核的菌种筛选流程，来选育组份好、效价高的新菌种，在具体操作中，我们利用薄层层析法(TLC)和纸层—生物显影法(P.B)进行组份分析和早期鉴别。用此方法不但能发现组份好的菌种，而且还有可能发现产生新组份的突变株(见筛选流程B)，通俗讲这种新方法即是将新抗生素筛选和菌种选育相结合的方法。两种筛选流程对比见图1。

其中首先获得成功的是氨基糖苷类抗生素——小诺霉素的研究成果。采用上述新方法，我们在1980～1981年间，从常规育种的数百株突变株中就发现了一株TLC行为不同于庆大霉素的突变株JIM-401^［1］，该菌株的发酵液在TLC分析时仅有两个主斑点，其Rf值分别与GMC₂和GMC_1a位置接近。根据庆大霉素生物合成途径(图2)，一般情况下，C₂应向C₁转化，而仅有C₂无C₁组份的完全阻断的可能性不大。因此对产生和C₂ Rf值相似的斑点是否属于C₂有疑问。经查阅文献GMC_2b(MCR或相模湾霉素，sagamicin)TLC的Rf值与GMC₂相近，而在纸层析分析时，C_2b组份与C₂组份的Rf值有差异，它的Rf值大于C₂，而又小于C₁，即介于C₂与C₁之间，借此可将两组份相区分。为此我们又将该突变株的发酵液做了纸层-生物显影分析，结果显示，这一新组份的位置恰好在C₁和C₂之间。因此就初步鉴别已获得一个不同于庆大霉素主要组份的新抗生素，而且可能是C_2b组份。为进一步确证它的结构，对该突变株所产生的新组份进行分离纯化，将其与进口相模湾霉素同时进行四大谱(UV，IR，MS，NMR)测定，并与文献值比较，结果表明，该突变株除产生C_1a组份外，还产生一个不同于庆大霉素主要组份的新组份C_2b。该突变株JIM-401的发酵液效价并不比亲株高，按常规选育法一般是不会挑选该菌株的，也就失去了发现新抗生素的机会。

图2是一个将常规菌种选育和新抗筛选的思维方式和鉴别手段结合起来，发现新抗生素小诺霉素的例子。

我国在抗生素发展初期，新抗生素筛选主要是从土壤微生物中进行分离筛选。这种经典的筛选方法随机性大，成功率低。随着抗生素生物合成的遗传学和生物化学知识的积累及方法学的发展，寻找新抗的思维方式进一步拓展，我国的学者、专家尝试采用新抗筛选的遗传学途径^［2］，以提高筛选的成功率。除突变生物合成，通过杂交向抗生素产生菌导入新的遗传信息和DNA片段改变抗生素产生菌的遗传结构等方法外，采用诱变方法诱导抗生素合成途径中某些酶的基团发生突变，以获得代谢途径中某些更有效的抗生素。特别对那些生物合成代谢途径已研究得较清楚的抗生素，可以利用筛选阻断型突变株，使其抗生素代谢途径中某一步发生阻断或原来未表达的某些与抗生素合成途径有关的基因获得表达(也即控制这步生物合成的酶被激活了)。由此可获得与生物合成途径有关的新抗生素。

图1

图2庆大霉素的生物合成途径

我们应用这一思路，进一步以小诺霉素产生菌JIM-401为出发菌株筛选得到了产GMC_1a单组份的JIM-202突变株，它是GMC_1a的6′-N-甲基化反应被阻断^［3］，又以JIM-202为出发菌株筛选得到能产生西索米星(SISO)的菌株JIM-121，它可能是SISO的还原这一步被部分阻断^［4］(图2)。这些阻断型菌株具有效价较高，发酵条件与原亲株比较接近等特点，故较易进行工业化生产，国产小诺霉素在短时间内的开发成功就是一个很好的例证。因此通过遗传学途径筛选和代谢有关的新抗生素组份是一个行之有效的方法。

2通过模仿(me-too)创制抗生素新药

20世纪70年代日本梅泽滨夫对卡那霉素(KM)的耐药现象进行研究后在其2-脱氧链霉胺1-N位上引进一个修饰基团-丁酰苷基后得到AMK。该新抗生素不但仍保持原有的抗菌作用并对各种耐药菌亦表现出卓越的抗菌活性，因而受到人们的关注。

20世纪80年代美国Schering公司成功地开发了另一个新的氨基糖苷类抗生素NTL，它是西索米星(sisomicin，SISO)2-脱氧链霉胺1-N位上引进一个乙基后所得，该半合成抗生素的性能比原母核SISO优越得多，不但抗菌和杀菌力强还对多种耐药菌具有较好的作用，且耳、肾毒性也比母核SISO低得多。

以后几年美国与日本学者合作又在GM-B 1-N位上接上一个丙酰苷基得到异帕米星(isepamicin，ISP)也具有上述特点，该新药于1988年投放市场。

此后日本又从双脱氧卡那霉素(DKB)1-N位上接上一个丁酰苷基得到阿贝卡星(arbekacin)并于1990年投放市场。

上述4个半合成抗生素均系2-脱氧链霉胺1-N位上引进一个修饰基团而得到，其特点是对耐药菌有效，耳肾毒性均比母核低。

我们在通过遗传学途径筛选菌种时，得到了一株单组份G