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STUDIES OF THE ANTI-AIDS EFFECTS OF MARINE POLYSACCHARIDE DRUG 911 AND ITS RELATED MECHANISMS OF ACTION
Geng Meiyu，Ding Hua，Xin Xianliang，Liang Pingfang
（Ocean University of Qingdao,Qingdao266003）
ABSTRACTThe anti-AIDS effects of marine polysaccharide drug 911 both in vitro and in vivo were studied in this paper. The results indicated that 911 inhibited both acute and chronic infection of HIV-1 to MT4 and H9 cells with its half effect concentration (EC50) at 4.44mg·L-1 and 0.32mg·L-1 respectively in vitro. While the half toxic concentration (TC50) of 911 to MT4 cells was 7.78 kg·L-1 and that to H9 cells 7.47g·L-1. And the in vivo study showed that oral administration 911 reduced the virus titer and decreased plasma RNA copies in the macaques at doses of 64mg·d-1 and 320mg·d-1. The protective effect on CD4+ cells and antibody-increasing activity of 911 were also found. Furthermore, 911 significantly interfered the adsorption of HIV to MT4 cells and suppressed activity of reverse transcriptase. These findings indicated that 911 inhibited the viral replication both in vitro and in vivo by blocking the adsorption of virus to host cells and counteracting the activity of reverse transcriptase and modulating immune function as well.
KEY WORDSMarine polysaccharide drug 911，AIDS，SIV，HIV-1，MT4，H9
硫酸多糖类药物抗病毒作用的研究始于60年代，它是有膜病毒强有力的抑制剂。1987年发现，多糖类药物具有抑制HIV增殖的作用，其作用机制与干扰病毒和细胞的吸附、阻止病毒进入细胞、抑制合胞体形成有关［1～3］。现有抗AIDS的药物主要有逆转录酶抑制剂和整合酶抑制剂，但其作用环节单一，易出现耐药性，毒副作用大，不能有效控制AIDS的迅速蔓延，理想的抗AIDS药物应该在有效抑制HIV复制的同时对机体免疫功能具有保护作用，且毒副作用低。体外研究发现该药可明显抑制HIV-1对MT4细胞感染和H9细胞的慢性感染，且毒副作用小，口服易吸收，为一低毒或近似无毒的HIV-1复制抑制剂，其作用机理与干扰病毒与细胞的吸附、抑制逐转录酶活性和增强机体免疫功能有关［4、5］。911是从海藻中提取分离并经分子修饰而成的硫酸多糖类化合物，其平均分子量为6000Da。本文旨在观察其体内对猴免疫缺陷病毒（SIV）在猴体内复制的抑制作用。
1实验材料
1．1药品与试剂
911：青岛海洋大学海洋药物与食品研究所提供，批号970601，用时以RPMI 1640营养液配成所需浓度，过滤除菌，4℃冰箱保存备用；RPMI 1640：GIBCO公司产品；胎牛血清(NBS)：天津市川页生物制品公司，批号 960606；P24核心抗原ELISA检测试剂盒（Vironostika HIV-1 Antigen Microelisa System）：美国Organon公司产品；AZT：叠氮脱氧胸苷，威-康公司，每粒100mg；MTT：四甲基偶氮唑蓝，Poly(A)-(dT)12，Sigma公司产品；［3H］TTP（［Methyl-3H］-deoxythymi-
dine-5′-triphosphate，tetrasodium salt），Dupont 公司；三羟甲基氨基甲烷（Tris），华美生物工程公司进口分装；二硫苏糖醇(DTT)，Boehringer公司；dATP，dTTP，dCTP，dGTP，Promega公司；病毒裂解液：0.5%Triton X-100，0.8mol*L-1 NaCl，0.5mM苯甲璜酰氟，20%甘油，50mM Tris-HCl (pH7.8)。
1．2实验仪器
酶标仪：Bio-Rad公司；CO2培养箱：Queue公司；流式细胞仪（FACS）：Vantage，美国BD公司；液闪计数仪：Beckman公司。
1．3实验动物
中国恒河猴，健康，一级动物，体重范围4～6kg，雌雄各半，购自中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心。实验前经体检无异常，经血清学间接免疫荧光(IFA)抗体检查法检查排除潜在的猴免疫缺陷病毒(SIV)，猴逆转录D型病毒（SRV）和猴T淋巴细胞性Ⅰ型病毒(STLV-Ⅰ)的感染。合格证编号：98105。用商品化膨化饲料饲养。
1．4病毒及细胞株
SIVmac239病毒株，美国Aaron Diamond艾滋病研究中心Marx博士惠赠，静脉途径感染恒河猴，感染剂量为3MID100。HIV-1，人免疫缺陷病毒I型，TCID50为10-6.5；MT4细胞，HIV-1急性感染人T淋巴细胞体外传代株；H9细胞，HIV-1慢性感染人T淋巴细胞体外传代株；均由中国预防医学科学院病毒所提供。
2实验方法
2．1911体内对SIV感染猴的影响
取恒河猴16只，雌雄各半，随机分为模型组、911（每只64、320mg）实验组及阳性药AZT（每只100mg）组。每只静脉注射SIVmac239病毒1mL，除模型组外，其余各组均于感染病毒后30min口服相应药物进行治疗，连续给药60d，每日给药1次。观察实验前后各组动物体重、营养状况、饮食、大小便等的变化情况；并收集感染SIV前和感染后第1、2、3、4、6、7周实验猴血浆或全血标本，采用敏感细胞株CEM×174进行培养滴定，采用定量PCR（QC-PCR）法进行病毒载量的测定［6］，采用IFA法测定荧光抗体水平，采用流式细胞术测定外周血CD4+细胞百分率及绝对数。
3实验结果
3．1911体内对SIV感染恒河猴的影响
一般情况观察：除全身淋巴结肿大外，动物一般情况良好，各组体重变化无明显差别，见图1。
图1911对SIV感染猴体重的影响
Fig1Effect of 911 on body weight of SIV-infected macaques
3．2911对SIV感染猴血浆病毒滴度的影响
感染对照组从感染后7d开始，所有动物血浆中均分离到病毒，2周左右病毒滴度达到高峰，以后病毒血症水平逐渐降低，8周时仍存在低水平的病毒血症，而AZT治疗组10d方有病毒出现，且滴度低于对照组；911的64mg及320mg两组动物的病毒血症水平与感染对照组相比均表现出了不同程度的抑制作用，主要表现在：(1)在病毒感染后7d病毒血症出现时，两组动物病毒分离阳性率较感染对照组动物低，分别为2/4、2/4(2)在病毒感染后2周病毒血症达到高峰时，两组动物的病毒血症水平均明显低于病毒感染对照组(3)病毒感染后3、4、6周时，两组动物均有病毒分离阴性出现，病毒分离阳性率均低于病毒感染对照组动物相对应的时间点。表明911及AZT均可显著降低血浆病毒滴度，抑制病毒增殖。结果见图2、3。
图2911对SIV感染猴血浆病毒滴度的影响
Fig2.Effect of 911 on the virus titer of SIV-infected macaques’plasma
图3911对SIV感染猴体内病毒增殖的抑制作用
Fig3.Inhibitory effect of 911 on siv Viral proliferation in macaques’plasm
3．3911对血浆病毒RNA拷贝数影响
取不同时间制备的感染SIV猴血浆，采用QC-PCR方法测定血浆中病毒RNA拷贝数，结果发现911可明显降低感染SIV猴血浆中病毒RNA拷贝数，尤以320mg效果最为明显（图4）。
