摘要壳多糖作为一种碱性天然多糖，由于其无毒且具有良好的生物及组织相容性而备受人们的重视，本文综述了壳多糖及其衍生物作为细胞培养微载体材料、生物微胶囊材料、基因转移载体、细胞培养生物因子及作为药物吸收促进因子5个方面的研究进展。

THE ADVANCE OF APPLIED RESEARCH OF CHITOSAN AND ITS DERIVATIVES IN ANIMAL CELL CULTURE

Wang XuminLiu WanshunHuo Jun

（Ocean University of Qingdao,Qingdao266003）

ABSTRACTAs a cationic natural polysaccharide, chitosan has attracted much attention in the area of cell culture for its good biocompatibility, good histocompatility and little toxicity. In this paper, the progress of study of chitosan and its derivatives are reviewed for they are used in microcarrier, biomicroencapsulation, gene delivery system, biological factor and drug absorption enhancer.

KEY WORDSChitosan and its derivatives, Cell culture

细胞培养(Cell culture)是人工模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下培养单个细胞或细胞群，并使其存活和生长繁殖保持其结构或功能的方法。细胞培养被广泛用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科的研究工作，也被用于生产生物制品、单克隆抗体和基因工程制品。壳多糖在近几年被广泛应用于细胞培养，这是由于壳多糖来源广泛、价格便宜、无毒、生物相容性好、可生物降解。并且壳多糖的单糖体上存在易于被修饰的O，N，所以经不同集团修饰可得到性质各不相同的衍生物，本文就近几年来壳多糖及其衍生物应用于细胞培养的研究进展作以综述。

1壳多糖(Chitosan)

甲壳质(Chitin)是由N-乙酰-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖以β-1，4-糖苷键形式连接而成的多糖，壳多糖是甲壳质经氨基上脱去乙酰基后得到的衍生物，壳多糖不能溶于水但能溶于低浓度无机酸或有机酸。壳多糖分子链上有许多游离氨基，在酸性溶液中能结合1个氢质子，而成为带正电荷的聚电解质。

甲壳质和壳多糖的糖残基上带有羟基，能和各种酸及其衍生物酯化，从而获得各种有机、无机酸的酯类化合物，如：硫酸酯、磷酸酯、乙酸酯、苯甲酸酯、氰乙酯等，这些酯类化合物有广泛的用途，例如：Wolfrom报道壳多糖硫酸酯的抗凝活性比肝素好。甲壳质和壳多糖的糖残基上的羟基可进行羟基化反应生成各种醚类，例如：甲基醚、乙基醚、苄基醚、羟乙基醚、羧甲基等，壳多糖的氨基属于一级氨基，氮上的氢比较活泼，能发生许多取代反应，例如：壳多糖在中性介质中与醛反应生成西佛碱；与羧酸酐高温下反应生成N-酰化衍生物，及获得N-烷基化产物等^［1］。这些衍生物与壳多糖相比有了新的特性，此外细胞载体和医用生物功能新材料具有广阔的用途。

2细胞培养载体

2.1细胞培养微载体(microcarrier)

哺乳动物细胞的大规模培养是生产许多医学上重要生物制品的主要方法之一，目前采用的微载体培养是一种工业化高密度培养动物细胞的有效体系^［2］，根据生产所需生物制品的不同，选择不同种类的细胞，目前常用于微载体培养的细胞主要有杂交瘤细胞、CHO细胞、成纤维细胞、Vero细胞、BHK细胞等60多种^［3］。用于动物细胞培养的微载体由传统的固体小颗粒微载体发展到现在的多孔微载体，多孔微载体用于高密度动物细胞培养是1985年由Verax公司开创的，最初用于流化床生物反应器生产单抗^［4］。与传统微载体相比多孔微载体有许多优点^［4］：（1）细胞容易固定，可以很好的培养贴壁依赖型动物细胞和悬浮细胞，可以使细胞在载体内部生长（2）保护细胞免受外界剪切力的损伤（3）适用于固定床、流化床、气升式及普通搅拌式等多种生物反应器（4）比表面积大，为细胞提供充分生长空间（5）可以长期固定培养细胞从而稳定获取细胞分泌产物。而细胞贴壁的好坏取决于微载体的材料，所以微载体材料的选择十分重要，通常把这些材料分成两大类：一类是非生物材料，包括塑料和玻璃等；另一类是生物材料，包括葡聚糖、琼脂糖以及纤连蛋白(fibronetin)、层粘连蛋白(laminin)等^［5、6］。作为海洋生物材料的壳多糖，由于具有很好的粘连性、生物组织相容性以及无毒、可生物降解等优点^［7、8］，近年来越来越多的被用于制备多孔微载体并用在动物细胞培养上。

丁明等^［8］利用液体石蜡作有机分散界质，甲醛、戊二醛作交联剂通过反向悬液交联法制备了微米级壳多糖微载体，可用于固定细胞。陈西广等利用自制壳多糖微载体培养Vero细胞发现，Vero细胞在壳多糖微载体上生长良好，Vero细胞在壳多糖载体上生长快、密度高，在1g*L^-1微载体浓度条件下，培养Vero细胞120h，细胞密度每毫升可达7.15×10⁵个，且具有良好形态。Kim等^［9］用壳多糖/海藻酸钠微载体包埋杂交瘤细胞，取得了很好的实验结果，用它培养细胞密度可高于悬浮培养细胞密度两个数量级，产生的单抗浓度是悬浮培养的20倍。Scholz M等^［10］利用卡拉胶/甲壳胺混合凝胶包埋动物细胞，并且在生物反应器上培养，由于卡拉胶/壳多糖包被细胞后，只允许小分子物质通过，而大分子物质不能通过，这样就便于收集生物反应器上所需的生物制品，Yagi K等^［11］利用果糖修饰的壳多糖包裹的微载体悬浮培养鼠的肝脏细胞，肝脏细胞在微载体表面生长良好，且在4d培养过程中保持一些肝脏特有的功能。

壳多糖资源丰富价格低，具有多种生物功能性和生物可降解性，因此壳多糖制备细胞培养多孔微载体将有广阔的应用前景。

2.2生物微胶囊

生物微胶囊是利用半渗透性生物高分子薄膜固定活体组织或细胞的微型胶囊，有人把这种生物微胶囊叫做人工细胞。

1980年加拿大多伦多大学的F.Lim和A.Sun发明了海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠(APA)微胶囊并用于包埋猪胰岛细胞取得成功，后来又包埋成功肝细胞^［12］。但是这种微胶囊中聚赖氨酸价格较高而使成本提高，后来人们又发现来源广泛价格便宜的壳多糖也可和海藻酸钠混合用于包埋细胞。

孙多先等利用海藻酸纳-壳多糖-海藻酸钠对肝细胞进行包埋，微胶囊化的肝细胞在PPMI1640培养液中保持活性，且能合成并释放低分子蛋白质，这种结构有利于肝细胞微胶囊植入体内后发挥功能而不被宿主免疫系统所排斥。用这种包埋材料还可以包埋胰腺胸腺和甲状腺等分泌腺细胞^{［12、13］}。

Matthew HW等^［14］利用羧甲基纤维素、硫酸软骨素A、壳多糖、多聚半乳糖混合制得的微胶囊培养兔的肝细胞，结果证明这种微胶囊可以很好地支持肝脏内皮细胞，并且优于海藻酸钠-聚赖氨酸-海藻酸钠制备的微胶囊。

Chandy T等^［15］实验了海藻酸钠-壳多糖-聚乙二醇(PEG)微胶囊，应用扫描电镜检测发现它的机械稳定性和蛋白扩散性能良好，用此胶囊包埋血红细胞并观察血红蛋白的释放，没有溶血现象且稳定性和生物相容性很好。

聚乙烯醇/壳多糖生物微胶囊用于包埋细胞，可以允许代谢产物及其他小分子物质自由运输，LiRH等^［17］成功运用这种生物微胶囊包埋PC12细胞，发现这种微胶囊可以改变细胞生长的微环境，从而提高了儿茶酚胺的分泌效率，并且由于微胶囊半径很小而提高其分散性。

Zielinski等^［16］分别利用壳多糖微胶囊成功培养PC12，R208F和R208N.8细胞。

以上说明利用壳多糖微胶囊可成功包埋培养胰脏细胞、肝脏细胞、PC12细胞等，这些在医学上有重要的价值。利用这项技术也可以制造人工器官，例如，利用包埋培养胰脏细胞壳多糖微胶囊生产胰岛素或移植到患者体内，可以治疗胰岛素依赖型糖尿病患者；PC12细胞可生产多巴胺，而帕金森氏(Parkinson's)病正是由于缺乏多巴胺。壳多糖是一种典型的PC12细胞生长基质，微胶囊化的细胞在体外可测得释放达到生理活性浓度达数月之久，所以用它来培养PC12细胞可用来生产多巴胺或用于移植到患者体内，而用于治疗帕金森氏病。

2.3细胞生长骨架系统

Elcin等^［18］报道，在修饰的壳多糖三维骨架上培养新鲜分离的胎猪肝细胞(FPH)并移植到小鼠身上，再经免疫组化分析，光镜及扫描电镜检测发现，FPH在壳多糖骨架上贴壁后形态学未发生变化，并且分泌肝细胞专一性细胞角蛋白。这是由于壳多糖的结构属糖胺聚糖，而糖胺聚糖在细胞贴壁、分化及形态发生过程中起着重要作用，所以壳多糖能很好的被细胞贴壁。

Kawase等^［19］用戊二醛交联壳多糖作肝细胞吸附的骨架系统，加上戊二醛交联后可以克服壳多糖凝胶发脆的缺点，肝细胞可很好的贴附于其表面，并保持类似于体内的圆形，经5d培养，仅能释放少量乳酸脱氢酶，并保持较高的脲合成的特性，表现出肝特有的功能。作为对照在胶原表面培养的肝细胞，其形状扁平，释放的乳酸脱氢酶多得多，脲合成的能力弱得多。这一结果表明肝细胞在戊二醛交联后的壳多糖微胶囊上能很好的生长，壳多糖作为肝细胞贴附骨架系统，可以用于人工肝脏