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THE INFLUENCE OF HIGH CONCENTRATION OF OXALATE ON G872 AND CALCIUM OXALATE MONOHYDRATE CRYSTALS INTERACTION
Deng GangZhang YanGeng MeiyuXing XianliangGuan Huashi
（Institute of Drugs and Food,Ocean University of Qingdao,Qingdao266003）
ABSTRACTIn our previous paper,we have addressed that the high concentration of oxalate interfered with the inhibitory activity of macromolecular weight inhibitors ,such as G872,on calcium oxalate monohydrate 1 crystals growth and agglomeration.The current paper focused on the mechanism of this influence by using of zeta potential measurement.Meanwhile［3H］G872 was also employed to study the influence of oxalate on crystals and G872 interaction.The results showed that the negative zeta potential values decreased from- 24.5mV to -20.6mV and -18.7mV(G872)in present of high concentration of oxalate of 0.2mmol.L－1 and 0.4mmol.L－1 respectively,revealed either less G872 binding to the crystal surface or weaker charged G872 binding to the crystal surface of combination.However the less radioactivity of crystals with hot G872 in present of high concentration of oxalate indicated exclusively less oxalate G872 binding to the crystal surface.
KEY WORDSHigh concentration oxalate,G872, Binding
自Robertson［1］的尿路结石症大分子抑制物学说建立以来，尿液大分子抑制物的研究已进行多年，在已发现的大分子抑制物中，糖胺聚糖（Glycosaminoglycans,GAGs)对草酸钙晶体和磷酸钙晶体的生长、聚集具有很强的抑制作用。由青岛海洋大学海洋药物与食品研究所以海藻为原料，经物理化学方法制得的古糖酯（G872）是一种海洋硫酸多糖。实验表明它在体外可以抑制一水草酸钙（COMH）晶体和磷酸钙晶体的生长和聚集［2，3］，并具有抑制COMH晶体向细胞表面粘附的作用［4］。此外，将G872加到正常人和复发性尿路结石症患者尿液中也可以显著提高尿液对COMH晶体生长和聚集的抑制活性，提示G872具有抑制含钙结石发病和复发的潜能。1997年Cao和Deng［5］报道高浓度草酸可能降低内源性糖胺聚糖（硫酸软骨素）和外源性硫酸多糖（G872）的抑制活性。本文研究高草酸对大分子抑制物粘附于COMH晶体表面后对zeta电位的影响，并应用［3H］G872研究高草酸条件下G872在COMH晶体表面粘附性的变化，从而部分地解释了高浓度草酸降低大分子抑制物抑制作用的原因。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1药品与试剂古糖酯（G872）：批号940517，青岛海洋大学海洋药物与食品研究所药化室提供（无定型白色粉末，分子量6000±500，纯度92％～95％）；［3H］G872：中科院原子能研究所选用循环曝射法制备，放射强度385MBq·mg－1，放射化学纯度大于95％；硫酸软骨素C（CS-C）：购自Sigma公司；多聚硫酸戊糖（SP54）：购自德国Bene Arzneimittel GmbH公司。实验用其它试剂均为分析纯。
1.1.2仪器Coulter DELSA 440型zeta电位仪：美国Coulter公司；Beckman LS 5000TD液闪仪：美国Beckman公司。
1.2方法
1.2.1一水草酸钙（calcium oxalate monohydrate,COMH)晶体的制备采用Sheehan和Nancollas法［6］。室温下，将1L
0.25mol·L－1的氯化钙溶液于1h内滴入1L 0.25mol·L－1的草酸钠溶液中，其间不断搅拌。形成的COMH晶体用蒸馏水冲洗多遍，直至溶液中检测不到氯离子为止。用纯水将晶体配成12mg·mL－1的混悬液，70℃振荡水浴保温2h。晶体使用前至少于常温下放置3周。粒度分析表明晶体平均直径为2.4μm,X-射线衍射测定晶体为COMH。
1.2.2人工尿液的配制［7］A液：每升纯水中含有二水氯化钙1.765g、硫酸钠4.862g、七水硫酸镁1.460g、氯化铵4.643g、氯化钾12.133g。B液：每升纯水中含有二水磷酸二氢钠6.800g、无水磷酸氢二钠0.869g、二水柠檬酸钠1.168g、氯化钠0.166g。
A液和B液分别于4℃冰箱中保存，使用前将A∶B∶纯水=1∶1∶18混合，然后加入20mmol·L－1的草酸钠溶液至终浓度为0.06mmol·L－1,人工尿pH6.0，离子强度0.033。
1.2.3高浓度草酸对大分子抑制物zeta电位的影响取3组1.5mL Eppendorff试管，各加入1mL 0.05mol·L－1(pH7.0)的PBS缓冲液，再在不同组别的试管中分别加入G872、SP54、硫酸软骨素C（CS-C）至终浓度为1mg·L－1；然后向第Ⅰ组试管中加入20μl 12mg·mL－1的COMH晶体悬液，向Ⅱ、Ⅲ组试管中先分别加入20mmol·L－1的草酸钠溶液至终浓度为0.2mmol·L－1和0.4
mmol·L－1，再加入与第Ⅰ组试管等量的COMH晶体，另设空白对照管只在试管中加入1mL PBS和COMH晶体。37℃振荡水浴中温育2h后10000rpm离心，沉淀的晶体经饱和草酸钙溶液冲洗3次，最后悬浮于3mL人工尿中，上机测定晶体的zeta电位。每检测点有6个小管，实验重复4次。
1.2.4高草酸对［3H］G872在COMH晶体表面粘附的影响取3系列 1.5mL Eppendorff 试管，各加入1mL 0.05ml·L－1(pH7.0)的PBS缓冲液，再分别于各系列试管中加入G872溶液至终浓度为0ng·mL－1、
125ng·mL－1、250ng·mL－1、500ng·mL－1、1000ng·mL－1,然后各试管均加入痕量的
［3H］G872。之后向Ⅰ系列试管中加入20μL 12g·L－1的COMH晶体悬液；第Ⅱ、Ⅲ系列试管先分别加入20mmol·L－1的草酸钠溶液至终浓度0.2mmol·L－1和0.4mmol·L－1,再加入与第Ⅰ系列试管等量的COMH晶体。所有试管于37℃振荡水浴中温育2h，10000rpm离心，分离出的晶体用饱和草酸钙溶液冲洗3次，最后用1ml 1mol·L－1的高氯酸将晶体溶解，取0.5mL溶液加入测量瓶中，再加入5mL闪烁液，上机测定放射强度。每检测点有6个小管，试验重复4次。
2结果
2.1高草酸对抑制物zeta电位的影响zeta电位是颗粒表面的电位，它表征了颗粒表面的带电特性，就尿路结石症体外研究而言，它是研究晶体与大分子抑制物、晶体与细胞作用的重要指标。颗粒表面的zeta电位数值越高，它们相互接近就需要越过更高的能量屏障，因此颗粒之间越不易碰撞而发生粘附。本实验结果表明（图1），与空白对照晶体表面的zeta电位值相比（-6.43mV),体系中加入大分子抑制物后的变化趋势一致,均可以提高zeta电位的负值3～4倍（-17．6～-24.5mV），提示抑制物粘附到晶体表面可以显著增加晶体表面的负电分布，其中G872的作用最强。但在高草酸（0.2mmol·L－1、0.4
mmol·L－1)下，zeta电位向正方向移动（-14．0～-20．6mV），提示高草酸条件下晶体表面的负电荷分布有所减少，表明高浓度草酸可以减少大分子抑制物在晶体表面的粘附或是降低了大分子抑制物表面的电荷数目。
图1高草酸对抑制物zeta电位的影响
抑制物：体系中仅有抑制物；抑制物＋：体系中草酸钠浓度为0.2mmol·L－1；抑制物＋＋：体系中草酸钠浓度为0.4mmol·L－1。
2.2高草酸对［3H］G872在COMH晶体表面粘附的影响所测放射性结果经与总放射性比较，得晶体表面放射性的百分数与G872浓度作图。结果（图2）表明，在3个系列溶液体系中，无草酸体系晶体上G872粘附最多，而随着草酸浓度自0.2mmol·L－1升至
0.4mmol·L－1，同－G872浓度检测点放射强度显著下降，并随草酸浓度的增加晶体表面的放射强度显著下降（P＜0.05或P＜0.01），提示高草酸能减少G872在COMH晶体表面的粘附。
