摘要本实验对螺旋藻多糖的抗癌作用进行了体内外实验研究和作用机理探讨。以0.3～1.5g·L^-1对B₃₇乳腺癌细胞的抑制率最高可达68.0％，对K₅₆₂白血病细胞抑制率为46.0％，对两细胞的IC₅₀分别为1.48和1.56g·L^-1。当螺旋藻多糖以300，150和75mg·kg^-1灌胃给药时，对小鼠S₁₈₀肉瘤的抑瘤率分别为55.2％，44.6％和33.8％；对H₂₂小鼠肝癌的抑瘤率分别为47.1％，36.4％和31.0%；对EAC小鼠腹水癌的抑瘤率分别为56.9％，44.7％和22.8％，同时具有明显提高荷瘤小鼠脾指数和胸腺指数的作用。以MTT法检测螺旋藻多糖的荷瘤小鼠脾淋巴细胞转化和对NK细胞活性的影响，也显示具有提高淋巴细胞转化率和促进NK细胞杀伤靶细胞的作用。测定螺旋藻多糖对脾淋巴细胞TNF-α诱生作用，大剂量组上清液可达75×10^-3IU·L^-1（对照组34×10^-3IU·L^-1），并有较好的剂量-效应关系。PSP治疗后的荷瘤小鼠其脾淋巴细胞产生白细胞介素-2（rIL-2）的功能增强。另外，口服螺旋藻多糖还具有一定提升或恢复因使用环磷酰胺所致动物外周血白细胞降低的作用。

螺旋藻多糖具有广泛的生物学活性。以往研究多集中于抗衰老，提高免疫作用等方面。近年来其在抗肿瘤方面的作用又引起了人们的重视。由于它是天然化合物，且具有无毒，高效的特点，明显不同于常用细胞毒类抗癌药，因此，有必要系统地研究其抗癌疗效和作用机理。本文以钝顶螺旋藻提取多糖并对该多糖在体内外的抗癌活性和作用机理进行了研究。

ANTITUMOR STUDIES ON THE POLYSACCHRIDES SPIRULINA PLATENSIS

Q Xianjun，Cui Shuxiang，Xie Yanying，Hou Jinling，Zhou ling，Dong Qiang

(Dept.Pharmacology,Institute of Medica Materia,Shandong Academy of Medical Science,Jinan 250062)

ABSTRACTThe antitumor effects of polysacchrides Spirulina Platensis (PSP) were studied in vivo and vitro.In vitro tests,the highest inhibited rates on B₃₇ mamma carcinoma cells and K₅₆₂ leukemic cells were 68.0％ and 46.0% respectively when the concentration was 0.3～1.5g·L^-1.In vivo tests,when the dosage were 300,150,and 75mg·kg^-1 p.o,the inhibited rates were 55.2％,44.6％ and 33.8%;47.1％,36.4％ and 31.0% and 56.9％,44.7％ and 22.8% respectively on the transplanted tumor cells of Sarcinoma 180,H₂₂ Hepatic tumor and EAC tumor cells in mice.PSP is biological activated substance which has widely immune effect.It had the effects of increasing the weight of spleen and thymus and of increasing proliferation of activated NK cell activity and TNF-α levels from 34×10^-3 to 75×10^-3IU·L^-1 and of having function of activated splenocyte to produce interleukin-2(rIL-2) in tumor-bearing mice.It is suggested that PSP has the ability to inhibit tumor andmechanism is partly to enhance immunity in tumor-bearing imce.In addition,enhancing or recovering the number of WBC which reduced by CTX is also important function in treatment of tumor.

KEY WORDS Polysacchrides Spirulina Platensis(PSP),Antitumor effect,Immune effect

1材料

1.1螺旋藻（Spirulina platensis）多糖（PSP）作者自己提取，白色粉末状结晶，纯度86.9％，将另文发表。

1.2动物Balb/c小鼠，体重19－22g，昆明种小鼠，体重19～22g，山东医科大学实验动物中心提供。

1.3化学药品和试剂rIL-2,每瓶2×10⁶IU，上海华新生物高新技术公司产品，批号970305；TNF-α和TNF-α单克隆抗体，由中国军事医学科学院邦定生物公司提供；放线菌素D（Actinomycin D),每支5mg，Fluka产品；四甲基偶氮唑盐（MTT）和CoA,Sigma 公司产品；济南假单胞菌苗（Pseudomonas Jinanese Vaccine 简称PJV），5-呋喃氟脲嘧啶（简称FT-207），齐鲁制药厂产品；96孔培养板，NUNCLON公司产品。

1.4肿瘤细胞株S₁₈₀小鼠肉瘤；HepA小鼠肝癌，EAC小鼠腹水瘤，B₃₇乳腺癌细胞，K₅₆₂白血病细胞，L₉₂₉TNF敏感细胞，CTLL-2 rIL-2依赖细胞均由本室保存。

1.5仪器DG3022A型酶联免疫检测仪，南京华东电子管厂出品；Forma311 型CO₂孵箱，Forma公司产品；GB303型电子分析天平，METTLER公司产品。

2方法

2.1PSP体外对B₃₇和K₅₆₂细胞的生长抑制作用观察

分别取对数生长期细胞，胰酶消化后以含10％FCS的RPMI1640培养液稀释细胞，按每孔10000加入96孔培养板中，每孔0.2mL,4h后加入不同稀释度的PSP，并以阿霉素（0.3mg·L^-1)作阳性对照，每个浓度设3个复孔，置37℃5％CO₂孵箱中连续培养72h,培养结束前4h各孔加入MTT10μL(5g·L^1)。经离心，洗涤加入DMSO充分震荡混匀后于酶标仪570nm处测A值。

2.2PSP对小鼠移植性肿瘤的抑制作用

无菌取传代后5d的瘤细胞悬液，经生理盐水稀释计数后调整细胞至2×10¹⁰～6×10¹⁰/L，接种于小鼠右侧腋下部位，每只0.2mL。次日随机分组，每组10只，对照组动物数为试验组鼠数×组数，分别为PSP大剂量组(300mg·kg^-1)中剂量组(150mg*kg^-1)，小剂量组(75mg*kg^-1)，FT207对照组(120mg*kg^-1)灌胃给药，每只0.8mL，每日1次，连续10d，同时设立PJV对照组（20mg*kg^-1,隔日皮下注射）。第11d处死小鼠取瘤块称重，计算抑瘤率，脾指数和胸腺指数。

2.3PSP促进荷瘤小鼠脾淋巴细胞转化实验^［1，2］

取Balb/c小鼠按上述方法接种S₁₈₀瘤细胞并分组给药10d。无菌取脾制成单细胞悬液，经NH₃ CI-Tris溶解、Hank′s液洗涤红细胞后以含10％ FCS的RPMI1640培养基调整细胞浓度1×10¹⁰／L，加入96孔板中，每孔0.1mL,设加CoA (0.1mL,10mg*L^-1)孔和不加CoA（加0.1mL培养基）对照孔，置5％CO₂37℃孵箱中培养72h，同2.1测A值，以各组加CoA孔OD值与不加CoA对照孔A值比较，计算淋巴细胞转化率。

2.4NK细胞活性测定^［1，2］

同2.3处理动物和制备脾细胞。取经CoA激活72h的脾细胞作效应细胞，洗去CoA后，调整细胞浓度至1×10¹⁰／L，每孔0.1mL, 入培养板中，即每孔1×10⁶，另取K₅₆₂细胞作为靶细胞，每孔加入2×10⁸／L，效应细胞，靶细胞＝50：1与上述不同药物处理的脾细胞作混合培养10h。同2.1测A值，以各组混合培养孔A值减去该组效应细胞培养孔A值，并与靶细胞孔A值之比得杀伤率（％）。

2.5PSP对荷瘤小鼠TNF-α的诱生作用测定^［3、4］

2.5.1TNF-α的诱生

动物分组及治疗方法同2.4制备培养脾细胞上清液。

2.5.2制备TNF-α标准曲线及各组上清液测定

以96孔培养板加入不同浓度的TNF-α标准品50μL（终浓度分别为20×10^-3，40×10^-3，60×10^-3和80×10^-3IU*L^-1），制定标准曲线。在另一区域，加入不同浓度的各组脾细胞诱导上清液50μL，共同加入终浓度为1mg*L的Act-D50μL，最后加入L₉₂₉细胞50μL,置37℃，5％CO₂孵箱中孵育20h。

2.5.3TNF-α中和试验

按（2.5.3）方法在96孔板中加入不同稀释浓度的TNF-α单克隆抗体50μL（终浓度1mg*L^-1)，混匀置37℃5％CO₂孵箱中。45min后再依次加入Act-D和细胞，同上培养20h。同2.1测A值。

2.6PSP对荷瘤小鼠脾淋巴细胞rIL-2水平的影响^［3、4］

2.6.1rIL-2诱生

动物处理方法同2.3制备脾细胞悬液，培养基稀释至5×10⁹/L，加入24孔板中，每孔1mL，再加入含CoA的培养液1mL(5mg*L^-1)，置37℃，5％CO₂的孵箱中培养24h，取上清液离心后-20℃备用。

2.6.2标准rIL-2活性的标定及各组诱导上清液的测定

将CTLL-2依赖细胞洗涤2次后稀释至4×10⁹／L，接种于96孔培养板中，每孔0.1ml（含4×10⁸/L），然后加入不同稀释浓度rIL-2的培养基0.1mL及待测上清0.1mL,置37℃，5％CO₂孵箱中培养48h。培养结<