摘要采用碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）诱导的大鼠血管平滑肌细胞（VSMC）增殖模型，对海洋硫酸多糖DPS抑制VSMC释放血管紧张素Ⅱ( AngⅡ )和内皮素-1(ET-1)的机理进行了初步探讨。取生长稳定的5～8代VSMC，以密度为每孔5×10⁴接种在24孔培养板内，在含10% M₁₉₉的培养液中37℃孵育。待细胞贴壁生长稳定后，将细胞分为正常对照组，bFGF组、DPS组、DPS与L-NAME联合用药（DPS+L-NAME）组。DPS组和DPS+L-NAME组分别在加入含有DPS (1mg·L^-1)的M₁₉₉培养液或含有DPS (1mg·L^-1)和一氧化氮合酶抑制剂（L-NAME, 0.1mg·L^-1)的培养液中预孵24 h后，正常对照组除外，各组均加入含终浓度为50 mg·L^-1 的bFGF继续培养24 h。用均相竞争放射免疫分析法测定VSMC上清液Ang Ⅱ 和ET-1的含量。结果表明，0.1mg·mL^-1的L-NAME 能完全阻断DPS抑制VSMC释放Ang Ⅱ的作用，但对ET-1的释放未见明显影响。提示一氧化氮可能介导DPS抑制VSMC释放Ang Ⅱ的作用，对抑制ET-1的释放则无介导作用。

THE MECHANISMS UNDERLYING THE INHIBITORY EFFECTS OF D-POLYMANNURONIC SULFATE ON PRODUCTION OF ANGIOTENSIN Ⅱ AND ENDOTHELIN-1

Zhu Haibo，Geng Meiyu，Qixin，Guan Huashi

(Department of pharmacology, Marine Drug and Food Institute, Ocean University of Qingdao, Qingdao 266003)

ABSTRACTThe mechanisms underlying the inhibitory effects of D-polymannuronic sulfated (DPS) on the production of angiotensin Ⅱ (Ang Ⅱ) and endothelin-1 (ET-1) in vascular smooth muscle cells (VSMC) via its stimulation on nitric oxide (NO) generation were investigated in this paper. VSMC were exposed to DPS (1mg·L^-1), or in combination of N^w-Nitro-L-Arginine Methyl Ester (L-NAME, 0.1mg·L^-1) incubated at 37℃ for 24 h, followed by addition of basic fibroblast growth factor (bFGF) at final concentration of 50 mg·L^-1 for another 24 h. Supernatant Ang Ⅱ and ET-1 levels were determined by radioimmunoassays. The results indicated that L-NAME completely blocked the inhibitory activitives exerted by DPS on Ang Ⅱ released from VSMC, but not on ET-1 production. Taken together, nitric oxideis presumed to participate in suppressing actions of DPS against the production of Ang Ⅱ, but not against the formation of ET-1 in vitro.

KEY WORDS D-polymannuronic sulfated， nitric oxide， angiotensin Ⅱ， endothelin-1， N^w-Nitro-L-Arginine Methyl Ester

从褐藻中提取分离并经化学结构修饰所得到的海洋硫酸多糖DPS（简称DPS）可抑制碱性成纤维细胞生长因子 (bFGF) 诱导的大鼠血管平滑肌细胞（VSMC）增殖^［1］。其作用机制与DPS促进VSMC中一氧化氮(NO)的生成，抑制VSMC释放血管紧张素II (Ang II) 和内皮素-1 (ET-1) 有关，但DPS是如何抑制VSMC释放Ang II和ET-1的机制尚不清楚。文献报道，NO有拮抗内源性生长因子如Ang II和ET-1的作用^［2］，提示，NO是否参与DPS抑制VSMC释放Ang II和ET-1的作用。 本文探讨DPS降低VSMC释放Ang II和ET-1的含量是否与NO介导有关。

1材料和方法

1.1药品和试剂

海洋硫酸多糖DPS由青岛海洋大学海洋药物与食品研究所提供。 M₁₉₉ 干粉培养基 (Medium 199)：美国Hyclone公司产品，批号：AHG8587B，9.6g，NaHCO₃：2.2g，青霉素100 U·L^-1，链霉素 100mg·L^-1，调pH 7.2～7.4；新生小牛血清（Fetal calf serum,FCS）：美国Hyclone公司产品，批号：AFC5005；碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）：北京白鹭园生物技术公司，批号：990826；胰蛋白酶（Trypsin）：美国Sigma公司产品，批号：79H6577；胶原酶I型（Collagnase type I）：美国Sigma公司产品，批号：47H0728；一氧化氮合酶抑制剂（N^w-Nitro-L-Arginine Methyl Ester, L-NAME)：美国Sigma公司产品，批号：98H1427；一氧化氮测定试剂盒，血管紧张素II和内皮素-1放免测试盒均为中国军事医学科学院北京邦定生物医学工程公司产品。其它试剂均为国产分析纯。

1.2实验材料和仪器

雄性Wistar大鼠（8～10周），青岛市药品检验所实验动物中心提供 (Certificate NO.980201)。超净工作台：上海净化设备厂；CO₂孵育箱：美国NUAIR公司生产；恒温水浴振荡器（HZS-H）：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司生产；倒置相差显微镜：日本Olympus公司产品；离心机（LD-Z4-0.8）：北京医用离心机厂生产； LKB-1275型γ免疫计数仪：芬兰Wallac公司产品。

1.3实验方法

1.3.1大鼠主动脉平滑肌细胞培养

参照文献［3］，用胶原酶消化法培养大鼠血管平滑肌细胞。3d后细胞成“峰-谷”交错状生长，待细胞铺满瓶底后即用0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA以1:2比例进行消化传代培养。实验用5～8代细胞。

1.3.2VSMC外液Ang Ⅱ and ET-1含量的测定

取生长稳定的5～8代VSMC，用 0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA(1:2)混合液消化，以密度为每孔5×10⁴接种在24孔培养板内37℃孵育。将细胞分为4组。正常对照组：加入培养液（10% FCS+M₁₉₉）；bFGF组：加入含bFGF 50 mg·L^-1的培养液；DPS组：加入含有DPS(1mg·L)的培养液; DPS+L-NAME组: 加入含有DPS(1mg·L^-1)和一氧化氮合酶抑制剂（L-NAME, 0.1mg·L^-1)的培养液。待细胞贴壁生长稳定后，DPS组和DPS+L-NAME组分别加入含有DPS(1mg·L^-1)的培养液或含有DPS(1mg·L^-1)和一氧化氮合酶抑制剂（L-NAME,0.1mg·L^-1)的培养液中预孵24 h后，正常对照组除外，各组均加入含终浓度50 mg·L^-1 bFGF的M199培养液继续培养24 h。用放免法测定VSMC外液Ang II 和ET-1的含量。

1.4统计学处理

本实验中所有数据均采用±s表示，组间分析采用t检验。

2结果

DPS单用及DPS与L-NAME 合用对VSMC外液Ang II and ET-1含量的影响

与正常对照组［Ang Ⅱ: (76.61 ± 2.62)μmol·L^-1; ET-1: （70.30±12.89）μmol·L^-1］相比，bFGF组VSMC外液的 Ang Ⅱ 和 ET-1含量分别增加了近3倍［（282.68±14.31）μmol·L^-1］和5倍［（442.63±22.64）μmol·L^-1］。DPS组VSMC外液Ang Ⅱ 和 ET-1的含量则明显下降 ［Ang II: （183.68±14.31）μmol·L^-1］;［ ET-1：（154.06±5.95）μmol·L^-1］，统计学分析表明，DPS组与bFGF组相比有高度显著性差异（P＜0.01）。 DPS降低VSMC外液Ang II的作用可被0.1mg·L^-1的L-NAME完全阻断 ［（282.88±19.37）μmol·L^-1］, 但L-NAME对DPS降低VSMC外液ET-1的作用则未见明显影响 ［（170.12±20.30）μmol·L^-1］ (见图1和图2）。

Fig.Ⅰ Effects of DPS alone on in combination with L-NAME on Ang Ⅱ in VSMC.bFGF:50mg·L^-1;DPS: 1mg·L^-1;L-NAME:0.1mg·L^-1.±s，^P＜0.01 vs bFGF-treated group

Fig.2 Effects of DPS alone on in combination with L-NAME on ET-1 in VSMC.bFGF:50mg·L^-1;DPS:1mg·L^-1;L-NAME:0.1mg·L^-1.±s，^P＜0.01 vs DPS-treated troup.

3讨论

本文初步探讨了DPS抑制VSMC释放Ang II和ET-1的作用机理。

生理状态下，基础NO可拮抗内源性血管生长因子如Ang Ⅱ和ET-1等的促VSMC增殖作用，两者之间保持着动态平衡。然而，在高血压病或动脉粥样硬化等病理状态下，内源性NO合成减少，Ang Ⅱ和ET-1等生长因子相对增多，导致VSMC增殖^［4］。我们在前期的体内外实验均发现，DPS可促进NO的合成，抑制Ang Ⅱ和ET-1的生成^［5］。但对DPS增加NO的合成与其降低Ang Ⅱ和ET-1的生成/释放之间的关系尚不清楚。有资料表明，内源性NO能抑制Ang Ⅱ合成的限速步骤——肾素（renin）的释放，而一氧化氮合酶抑制剂L