¹Hokkaido College of Pharmacy, Katsuraoka 7-1, Otaru 047-02, Japan)

ABSTRACTAIM: To evaluate the pharmacological action of icariin in traditional Chinese medicines.METHODS: Icariin was given orally to rats, the major metabolites of icariin in gastric, small intestinal, urine and bile samples were determined and isolated by HPLC and identified by chemical and spectroscopic evidences.RESULTS: Two metabolites, icariside II and icaritin in both small intestine and urine, and two metabolites, icaritin-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-7-O-β-D-glucopyranuronoside and icariside II in bile were identified. The major metabolic route of orally administered icariin in rats was also proposed.CONCLUSION: Icariin is metabolized prior to absorption and exists mainly as its metabolites in vivo.

KEY WORDSicariin; icariside II; icaritin; icaritin 3-O-α-L-rhammopyranosyl-7-O-β-D-glucopyranuronoside; metabolite

摘要目的：为阐明淫羊藿苷在体内的作用形式，对淫羊藿苷的代谢产物及活性进行研究。方法：将淫羊藿苷给大鼠ig后，分析、分离并鉴定了其在小肠、尿、胆汁中的主要代谢产物。结果：在小肠及尿中鉴定有淫羊藿次苷II(icariside II)及淫羊藿素(icaritin)，胆汁中有淫羊藿素3-O-α-L-鼠李吡喃糖基-7-O-β-D-葡萄吡喃糖醛酸苷(icaritin 3-O-α-L-rhamnopyranosyl-7-O-β-D-glucopyranuronoside)和淫羊藿次苷II，并对淫羊藿苷在大鼠体内主要代谢途径进行了探讨。结论：淫羊藿苷在吸收之前已发生代谢，在体内主要是以其代谢产物的形式存在。

关键词淫羊藿苷；淫羊藿次苷II；淫羊藿素；淫羊藿素3-O-α-L-鼠李吡喃糖基-7-O-β-D-葡萄吡喃糖醛酸苷；代谢产物

淫羊藿苷(icariin)为淫羊藿的主要黄酮类化合物之一^［1,2］，并且广泛应用于药材淫羊藿的质量监控^［3,4］。目前有许多有关淫羊藿苷药理、化学及生化研究的报道^［5～9］，但几乎所有的体内药理实验都采用非经口给药途径，而淫羊藿无论是单味入药还是组成复方入药均为口服用药，因此评价中药中淫羊藿苷的药理活性应遵循口服这一用药形式。据有关文献报道，黄酮苷类化合物在胃肠道要发生代谢^［10,11］，吸收进入体内的成分是其代谢产物而不是原形成分。本文主要介绍给大鼠ig淫羊藿苷后，小肠、尿及胆汁中代谢产物的分析、分离及结构鉴定。

实验部分

1仪器、药品及动物

淫羊藿苷(icariin)，从朝鲜淫羊藿Epimedium koreaum Nakai分得并经光谱鉴定。分析型HPLC采用的色谱柱为Inersil ODS-2(5 μm, 4.6 mm×250 mm)。核磁共振波谱 仪系ARX-300 Spectrometer，化学位移以四甲基硅烷为内标，ESI-MS 由PCQ Spectrometer测得。β-葡糖醛酸酶购于Sigma公司(USA)，♂ Wister大鼠200～250 g购于沈阳药科大学动物室。

2胃、小肠、尿及胆汁分析样品的制备及色谱条件

2.1胃分析样品的制备淫羊藿苷给幽门结扎的大鼠ig 20 mg·kg^-1(空白为相应的生理盐水)，4 h后取胃，用甲醇10 ml超声提取内容物5 min，离心，取上清液，用0.45 μm孔径的过滤器过滤制成HPLC样品，进样20 μl。HPLC条件为流动相含0.5%醋酸的MeOH—H₂O由70∶30(0～20 min)到85∶15(20～50 min)，检测波长为360 nm。

2.2小肠分析样品的制备大鼠ig淫羊藿苷200 mg·kg^-1(空白为相应量的生理盐水)，4 h后取小肠部分，切碎，加甲醇20 min超声提取5 min，离心，取上清液，40℃减压浓缩后再加甲醇2 ml超声提取1 min，离心，取上清液用0.45 μm孔径的过滤器过滤，制成HPLC样品，进样20 μl 。HPLC条件同2.1。

2.3尿分析样品的制备大鼠ig淫羊藿苷200 mg·kg^-1(空白为相应量的生理盐水)，收集0～36 h的尿液，40℃减压浓缩，加甲醇10 ml，超声提取5 min，离心，取上清液浓缩，加甲醇1 ml，超声提取1 min，离心，取上清液用0.45 μm孔径的过滤器过滤，制成HPLC样品，进样20 μl。HPLC条件：流动相为MeOH—H₂O(75∶25)；检测波长为360 nm。

2.4胆汁分析样品的制备大鼠ig淫羊藿苷200 mg·kg^-1(空白为相应量的生理盐水)，收集2～8 h胆汁，用0.45 μm孔径的过滤器过滤，制成HPLC样品，进样20 μl。HPLC条件：流动相为含有0.5%醋酸的MeOH—H₂O由60∶40(0～15 min)到75∶25(15～60 min)；检测波长为360 nm。

3尿、胆汁中代谢产物的分离

大鼠ig淫羊藿苷200 mg·kg^-1，收集36 h尿液约1 L，40℃减压浓缩，然后用甲醇200 ml提取3次，合并提取液，浓缩，残渣用甲醇溶解，经过反复Sephadex柱色谱分得U-1及U-2部分，再经高效液相制备色谱(色谱柱：Inersil prep ODS,20 mm×250 mm，流 动相：MeOH—H₂O(80∶20)，流速：3 ml·min^-1)。分得U-1(69 mg)及U -2(43 mg)。

大鼠ig淫羊藿苷200 mg·kg^-1，麻醉后将硬质细塑管插入大鼠的胆管中，收集胆汁约200 ml，加甲醇约200 ml沉淀杂质，离心，上清液经Sephadex柱色谱及高效液相制备色谱(MeOH—H₂O=65∶35及80∶20)分得B-1(23 mg)，B-2(2 mg)。

4酶水解

B-1(0.5 mg)与β-葡糖醛酸酶4 μl在0.1 mol·L^-1醋酸缓冲液(pH 5.0)中37℃反应3 h，在高效液相色谱上检测出降解产物中含有淫羊藿次苷II(icariside II)。

5结构鉴定

U-1(淫羊藿次苷II,icariside II):黄色粉末, mp 207～209℃，HCl—Mg反应及Molish反应均显阳性。¹HNMR(DMSO-d₆) δ:0.77(3H,d,J=5.6 Hz,CH₃),1.61(3H,s,CH₃),1.66(3H,s,CH₃),3.34(2H,m,1″-H),3.84(3H,s,OCH₃),5.14(1H,brs,2″-H),5.25(1H,brs,鼠李糖端基氢),6.29(1H,s,6-H),7.10(2H,d,J=8.5 Hz,3′,5′-H),7.84(2H,d,J=8.5 Hz,2′,6′-H),12.46(1H,s,5-OH)。¹³CNMR(DMSO-d₆) δ:156.6(C-2),134.5(C-3),177.9(C-4),161.3(C-5),98.6(C-6),162.4(C-7),106.0(C-8),153.9(C-9),104.0(C-10),122.5(C-1′),130.5(C-2′,6′),114.1(C-3′,5′),158.9(C-4′),21.3(C-1′),122.5(C-2″),131.0(C-3″),25.5(C-4″),17.8(C-5″),55.5(OCH₃),102.0(R-1),70.4(R-2),70.7(R-3),71.2(R-4),70.1(R-5),17.5(R-6)。R=rhamnopyranosyl。

U-2(淫羊藿素，icaritin):淡黄色粉末,mp 228～230℃,HCl—Mg反应阳性。¹HNMR(DMSO-d₆) δ:1.61(3H,s,CH₃),1.73(3H,s,CH₃),3.41(2H,d,J=5.9 Hz,1″-H),3.82(3H,s,OCH₃),5.16(1H,brs,2″-H),6.28(1H,s,6-H),7.10(2H,d,J=8.5 Hz,H-3′,5′),8.10(2H,d,J=8.5 Hz,H-2′,6′),9.42(1H,s,3-OH),10.70(1H,s,7-OH),12.30(1H,s,5-OH)。¹³CNMR δ:146.3(C-2),136.0(C-3),176.3(C-4),160.6(C-5),97.9(C-6),161.3(C-7),105.7(C-8),153.6(C-9),103.1(C-10),122.6(C-1′),129.2(C-2′,6′),114.2(C-3′,5′),158.4(C-4′),21.3(C-1″),123.6(C-2″),131.1(C-3″),25.5(C-4″),17.9(C-5″),55.5(OCH₃)。

B-1(淫羊藿苷3-O-α-L-鼠李吡喃糖基-7-O-β-D-葡萄吡喃糖醛酸苷，icaritin 3-O-α-L-rhamn opyranosyl-7-O-β-D-glucopyranuronoside):黄色粉末,mp 164～167 ℃,HCl—Mg反应及Molish反应阳性。阴离子ESI-MS m/z:689(M-H)^-,513(M-H-C₆H₈O₆)^-,366(M-H-C₆H₈O₆-C₆H₁₁O₄)^-。阳离子ESI-MS m/z:691(M+H)⁺,545(M+H-C₆H₁₀O₄)⁺,369(M+H-C₆H₁₀O₄-C₆H₈O₆)⁺。¹HNMR(DMSO-d₆) δ:0.78(3H,d,J=6.0 Hz,CH₃),1.59(3H,s,CH₃),1.67(3H,s,CH₃),3.37(2H,br.s,1″-H),3.85(3H,s,OCH₃),5.18(1H,br.s,2″-H),5.20(1H,d,J=7.1 Hz,葡糖醛酸基端基氢),5.27(1H,br.s,鼠李糖基端基氢),6.63(1H,s,6-H),7.12(2H,d,J=8.5 Hz,3′,5′-H),7.88(2H,d,J=8.5 Hz,2′,6′-H),12.56(1H,s,5-OH)。¹³CNMR(DMSO-d₆) δ:157.3(C-2),134.7(C-3),178.2(C-4),160.0(C-5),97.9(C-6),162.0(C-7),108.5(C-8),153.1(C-9),105.7(C-10),122.2(C-1′),130.5(C-2′, 6′),114.0(C-3′,5′),159.0(C-4′),21.4(C-1″),122.0(C-2″),131.1(C-3″),25.4(C-4″),17.8(C-5″),55.5(OCH₃),102.0(R-1),70.3(R-2),70.6(R-3),71.1(R-4),70.0(R-5),17.4(R-6),100.0(G-1),73.0(G-2),75.8(G-3),71.2(G-4),75.3(G-5),170.0(G-6)。R=rhamnopyranosyl;G=glucopyranuronosyl。

结果