AND EFFECT OF AMILORIDE ON THE CURRENT

IN GUINEA PIG VENTRICULAR MYOCYTES

Liang Yong(Liang Y), Zhang Yalan(Zhang YL) and Wang Xiaoliang(Wang XL)

(Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and

Peking Union Medical College, Beijing 100050)

ABSTRACTAIM: To study the effects of various extracellular Ca²⁺ concentration and amiloride on Na⁺-Ca²⁺ exchange current(I_Na-Ca) in guinea pig ventricular myocytes.METHODS: Through setting up the model of intracellular Na⁺-overload during myocardial ischemia and reperfusion, the current-voltage relationship of I_Na-Ca was recorded using whole-cell patch clamp technique with a declining ramp pulse protocol.RESULTS: Amiloride can block the I_Na-Ca significantly. At potential of +50 mV, amiloride 10^-5, 3×10^-5 and 10^-4 mol·L^-1 inhibited the I_Na-Ca by 15.4%, 22.6% and 40.9%, respectively; at potential of -80 mV amiloride inhibited I_Na-Ca by5.6%, 14.6% and 23.2%, respectively.CONCLUSION: Intracellular Na⁺-overload can activate Na⁺-Ca²⁺ exchange system which can be affected by extracellular Ca²⁺. Amiloride can block I_Na-Ca in guinea pig ventricular myocytes. Its inhibition effects on outward currents were greater than those on inward currents.

KEY WORDSNa⁺-Ca²⁺ exchange current; amiloride; ventricular myocytes; whole-cell patch clamp technique

摘要目的：研究胞外不同Ca²⁺浓度对豚鼠心室肌细胞钠-钙交换电流(Na⁺-Ca²⁺ exchange current， I_Na-Ca)的影响和阿米洛利(amiloride)对该电流的作用。方法：建立缺血再灌时胞内Na⁺超载的细胞模型，用膜片钳全细胞技术，记录I_Na-Ca的电流-电压关系曲线。结果：阿米洛利10^-5，3×10^-5和10^-4 mol·L^-1，在+50 mV时，对I_Na-Ca的抑制率分别是15.4%，22.6%和40.9%；在-80 mV时抑制率分别是5.6%，14.6%和23.2%。结论：胞内Na⁺超载确可引起Na⁺-Ca²⁺交换系统激活；阿米洛利对豚鼠心室肌细胞I_Na-Ca有抑制作用，且对I_Na-Ca外向成分的抑制作用大于对内向成分的抑制作用。

关键词Na⁺-Ca²⁺交换电流； 阿米洛利； 心室肌细胞； 膜片钳

Na⁺-Ca²⁺交换系统作为调节细胞钙转运的重要机制之一已经受到广泛的重视。胞内Ca²⁺作为重要的第二信使存在于许多细胞中，而这些细胞上都有大量的Na⁺-Ca²⁺交换体，尤以哺乳动物心肌细胞中含量最多，平均约有250个交换体(μm²)^-1，转换率达2500次·s^-1［1］。心肌细胞通过Na⁺-Ca²⁺交换可以排出由于Ca²⁺通道开放进入细胞的大量Ca²⁺，调节胞内Ca²⁺浓度(［Ca²⁺］i)；通过Na⁺-Ca²⁺交换反向转运进入细胞的少量的Ca²⁺，可以触发肌浆网释放大量Ca²⁺(即钙诱导的钙释放，CICR)，产生兴奋-收缩藕联^［2］；以3Na⁺∶1Ca²⁺进行交换的Na⁺-Ca²⁺交换体可以产生Na⁺-Ca²⁺交换电流(I_Na-Ca)，I_Na-Ca与心肌细胞动作电位的形成和心律失常的产生有关^［3］。

在心肌缺血再灌注损伤中，I_Na-Ca有至关重要的作用。有关心肌缺血再灌损伤的发生机制有很多假说，但都离不开胞内Ca²⁺超载这一重要环节，而在缺血再灌时，外向的I_Na-Ca与胞内Ca²⁺超载的关系密不可分。长期以来，由于缺乏有效的能直接记录到类似缺血再灌时明显增大的外向I_Na-Ca的方法，临床上至今还没有一种能有效地作用于外向I_Na-Ca的药物。本实验，通过增加电极内液中Na⁺浓度，建立缺血再灌时胞内Na⁺超载的细胞模型，研究胞内Na⁺超载引起的I_Na-Ca的改变。同时，我们还观察了胞外不同Ca²⁺浓度和Na⁺-H⁺交换抑制剂阿米洛利(amiloride) 对豚鼠心室肌细胞I_Na-Ca的作用。

材料与方法

细胞制备♂豚鼠，体重250～280 g，击昏、颈动脉放血后，迅速开胸，取出心脏，在4℃无钙液中去除脂肪及心包膜，进行Langendorff灌流。用无钙液经主动脉逆行灌流6 min，再用含链霉蛋白酶E(pronase, E.Merck) 0.1 mg·ml^-1，牛血清白蛋白(BSA，Sigma) 0.5 mg·ml^-1，［Ca²⁺］为0.15 mmol*L^-1的无钙液灌流2 min。整个灌流过程中压力维持在约70 cm水柱，37℃恒温，持续通95%O₂和5%CO₂混合气。将心室肌剪碎，用酶液37℃温孵搅拌5～10 min，倒出上清液，用无钙液稀释5倍，其中含BSA 0.5 mg·ml^-1，［Ca²⁺］为1.8 mmol·L^-1，室温下静置1h备用。

药品与溶液阿米洛利(amiloride)、氯化镍(NiCl₂)、氯化铯(CsCl)、氢氧化铯(CsOH)、维拉帕米(verapamil)、氯化钡(BaCl₂)、氯化钙(CaCl₂)、哇巴因(ouabain)、牛磺酸(taurine)，均为美国Sigma公司产品；其余试剂均为国产分析纯。无钙液成分(mmol·L^-1)： NaCl 90， KCl 10， KH₂PO₄ 1.2， MgSO₄ 5，NaHCO₃ 15，taurine 30，glucose 20，pH 7.4；台氏液成分(mmol*L^-1)：NaCl 140，MgCl₂ 2.0，Hepes 5，glucose 10，CaCl₂ 1.8，用CsOH调至pH 7.4；记录电流的电极内液(mmol·L^-1)：NaCl 15，EGTA 42，CaCl₂ 29，MgCl₂ 13，Aspartic acid 42， TEA 20， Hepes 5， Na₂ATP 5，用CsOH调至pH 7.4。为了减少其它电流成分的干扰，实验时细胞外液中加入： ouabain 20 μmol·L^-1阻断Na⁺-K⁺泵，BaCl₂ 1 mmol·L^-1和CsCl 2 mmol·L^-1阻断钾通道，verapamil 1 μmol·L^-1阻断L-型钙通道。电极内液中20 mmol·L^-1的TEA可以阻断钾通道；高浓度的EGTA和CaCl₂根据Fabiato & Fabiato公式计算得游离Ca²⁺浓度为153 nmol·L^-1［4］。

全细胞记录选取横纹清晰、膜良好的细胞进行实验。细胞池体积约1 ml，平放在连有微操纵器(MO-303，Narishige Co.，Japan) 的倒置显微镜(Olympus IMT-2，Japan)上，取几滴细胞悬液加入细胞池中，静置5 min使细胞充分贴壁后，用台氏液灌流，速度约为1～2 ml·min^-1。电极用玻璃毛细管(中国科学院上海脑研究所)经微电极拉制仪(PB-7 Narishige Co.，Japan) 分两步拉制，充灌电极液后电阻为1～3 MΩ。全细胞记录过程中，刺激脉冲的产生和信号采集均由pCLAMP 5.5.1软件(Axon Instrument，USA) 完成，离子电流通过膜片钳放大器(L/M EPC-7, Germany)放大，经AD/DA转换板(Axon TL-1，USA)输入IBM-PC机硬盘中。记录I_Na-Ca时，细胞钳制在-40 mV，给予从+60 mV复极化至-100 mV、速度为80 mV·s^-1持续2 s的斜坡脉冲。所有实验均在32～35℃下进行。

数据分析与统计电流的测量分析用pCLAMP 5.5.1 和pCLAMP 6.0.1软件，所有数据均为平均数±^S；配对和非配对t检验，P＜0.05认为差异有显著性。

结果

1钠-钙交换电流的记录

细胞钳制在-40 mV，先去极化至+60 mV，再给以持续2 s速度为80 mV·s^-1的斜坡刺激，复极化至-100 mV，频率为0.05 Hz。在该刺激条件下，用正常台氏液灌流时，记录到一个由外向到内向的电流，由于其它时间依赖性的电流都被阻断，因此记录到的电流几乎呈线性，该电流可被5 mmol·L^-1 Ni²⁺阻断。如图1所示，用Ni²⁺前后记录到的电流相减，即Na⁺-Ca²⁺交换电流(I_Na-Ca)^［1,4,5］。由于Na⁺和Ca²⁺的交换比是3∶1，因此，以Na⁺的转运方向作为I_Na-Ca的方向。I_Na-Ca的反转电位在-20 mV左右，当膜电位大于反转电位，该电流为外向，即胞内Na⁺与胞外Ca²⁺之间进行交换，结果造成胞<