CURVE IN HUMAN PLASMA BY HPLC

Ding Li(Ding L), Yang Jin(Yang J), Hua Yaping(Hua YP), Zhou Wei(Zhou W),

Zhang Zhengxing(Zhang ZX) and An Dengkui(An DK)

(Department of Pharmaceutical Analysis, ¹Research Center of Pharmacokinetics,

China Pharmaceutical University, Nanjing 210009)

ABSTRACTAIM: To develope an HPLC method for the study of plasma concentration-time curve of coenzyme Q₁₀ (CoQ₁₀) in human body.METHODS: Chromatography was performed on a Spherisorb C₁₈ column (25 cm×4.6 mm ID) with ethanol-water-acetic acid (98∶2∶0.7) as mobile phase. The detection wavelength was 275 nm. The internal standard was coenzyme Q₉ (CoQ₉). After deproteinization with ethanol, the plasma was extracted with n-hexane.RESULTS: A good linearity was obtained from 0.2～4.0 μg·ml^-1 of CoQ₁₀ in human plasma with a correlation coefficient of 0.9998. The extraction recovery was more than 90%. The plasma concentration-time curve of CoQ₁₀ of eight volunteers was determined by this method following a controlled clinical experiment.CONCLUSION: The established HPLC method was proved to be a good mehtod for the determination of CoQ₁₀ in human plasma. The experimental results showed that the human plasma concentration of endogenous CoQ₁₀ was (763.3±86.3) ng·ml^-1 and was affected by food and movement.

KEY WORDScoenzyme Q₁₀; HPLC

摘要目的：建立人血浆中辅酶Q₁₀的高效液相色谱检测法，以测定人体内辅酶Q₁₀的经时变化过程。方法：血浆经无水乙醇沉淀蛋白后，以正己烷提取，进行高效液相色谱法检测。色谱柱为Spherisorb C₁₈ 10 μm 25 cm×4.6 mm ID，流动相为无水乙醇—水—冰醋酸(98∶2∶0.7)，检测波长为275 nm，内标为辅酶Q₉。结果：在0.2～4.0 μg·ml^-1浓度范围内峰面积比与浓度呈良好的线性关系，γ=0.9998，方法重现性好，提取回收率大于90%；以本法测定了8名男性健康受试者服用辅酶Q₁₀制剂前后血浆中辅酶Q₁₀的浓度经时变化过程。结论：用本法测定人血浆中辅酶Q₁₀浓度结果满意；人血浆中内源性辅酶Q₁₀浓度为(763.3±86.3) ng·ml^-1，且受饮食及运动量的影响。

关键词辅酶Q₁₀；高效液相色谱法

辅酶Q₁₀^［1］(coenzyme Q₁₀，CoQ₁₀)商品名为Ubidecarenone，系动物体内的一种内源性物质，广泛存在于线粒体的内膜中，是组成呼吸链的必要成分，在体内通过线粒体内膜酶系的作用下由对羟基苯甲酸及异戊烯焦磷酯合成。临床上CoQ₁₀主要用于基础治疗过程中出现的轻度或中度的充血性心力衰竭，以改善浮肿，肺充血，肝肿胀和心绞痛等症状。由于CoQ₁₀为内源性物质，因此在监测受试者或病人服用CoQ₁₀制剂后体内CoQ₁₀浓度变化，需建立一种不同于外源性物质测定的方法。有关CoQ₁₀血药浓度测定方法至今尚未见报道，虽国外有几篇文献^［2～5］涉及体内CoQ₁₀的HPLC测定方法，但均未在方法的可行性方面进行论证，且采用的样品预处理步骤涉及薄层色谱纯化等，比较繁琐。本文设计了较为方便实用的血浆中CoQ₁₀的HPLC测定方法，并用该法对8名健康志愿者1 d内血浆中内源性CoQ₁₀浓度变化情况及口服丹麦Pharma Nord公司生产的CoQ₁₀软胶囊Bio-Qinon后的体内CoQ₁₀血药浓度变化情况进行了研究。

实验部分

1仪器与试药

可变波长紫外检测器；Shimadzu C-R6A数据处理机；CoQ₁₀对照品(Sigma公司)；辅酶Q₉(Sigma公司，简称CoQ₉)；Bio-Qinon软胶囊(丹麦Pharma Nord公司，每粒含CoQ₁₀ 10 mg，批号97117)；无水乙醇、正己烷、冰醋酸均为分析纯。

2色谱条件

色谱柱为Spherisorb C₁₈ 10 μm 25 cm×4.6 mm ID，流动相为无水乙醇—水—冰醋酸(98∶2∶0.7)，流速1 ml·min^-1，检测波长为275 nm，灵敏度为0.0010 AUFS，温度为22～23℃。

3血药浓度测定方法

由于CoQ₁₀及内标CoQ₉遇光不稳定，故样品处理及测定需避光进行。

于暗室中，取血浆0.6 ml置离心管中，加15 μg·ml^-1 CoQ₉乙醇溶液40 μl，摇匀，加无水乙醇2 ml，涡旋10 s，加正己烷5 ml，涡旋5 min，3 000 r·min^-1离心5 min，取正己烷层4 ml，于37℃水浴中以氮气流吹干，残渣加无水乙醇100 μl溶解，取20 μl按上述色谱条件进样分析。

4受试者

8名健康男性受试者，体重(64.5±6.3) kg，年龄(21.0±1.0)岁，经生化检验证实肝、肾功能正常，心电图检查正常，精神状态良好。实验前一周及实验期间禁烟酒，并未服用其它任何药物。

5人血浆中内源性CoQ₁₀浓度测定方法

8名受试者先接受饮食控制，包括统一食谱、统一饮食总量、统一用餐时间及限制食用动物性油脂。每日用餐时间为上午7∶00，中午12∶00，下午5∶15。于饮食控制的第3 d早饭后0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，6.0，8.0，12.0，24.0 h于肘静脉取血3 ml，测定受试者未服药时血浆中内源性CoQ₁₀的浓度变化。

6CoQ₁₀给药方案及给药后血样的采集

给药方案：8名受试者从饮食控制的第4 d开始，每人po Bio-Qinon，每次剂量为40 mg(tid)每次间隔8 h，每天上午7∶00开始服药，连续po药4 d，第5 d上午再po 1次，剂量仍为40 mg。

取血时间：受试者服药后的前4 d，每天早晨服药前于肘静脉取血1次，每次3 ml。服药后第5 d于早饭服药后0，1.0，2.0，3.0，4.0，6.0，8.0，12.0，24.0 h于肘静脉取血3 ml，测定血浆中CoQ₁₀浓度。

结果与讨论

1血浆提取方法的选择

CoQ₁₀难溶于水，微溶于乙醇，易溶于正己烷，乙醇与正己烷互不相溶。故血样经醇沉后，以正己烷为提取溶剂可获得较高提取率。实验中考察了以醋酸乙酯、正己烷、苯直接提取血浆的方法，但CoQ₁₀的提取率均不高。说明CoQ₁₀在血浆中与血浆蛋白结合，难于以有机溶剂直接提取，但当血浆中加入乙醇沉淀蛋白后，CoQ₁₀与蛋白质的结合被解除而游离出，再以正己烷提取可得较高的提取率。

2HPLC流动相的选择

曾试用甲醇—水(95∶5)为流动相^［2～5］，结果CoQ₁₀保留时间太长，进样后1 h仍不出峰。改用无水乙醇—水(98∶2)为流动相，则色谱行为大为改善，但血浆中一些内源性物质在色谱图中出现宽而拖尾的干扰峰，影响测定，当中性流动相被改为酸性流动相无水乙醇—水—冰醋酸(98∶2∶0.7)后，干扰峰被排除，干扰物出现时间提前，而流动相酸化后并未导致CoQ₁₀及CoQ₉保留时间的明显改变。

3色谱行为

血浆样品按上述“血药浓度测定方法”项下分析所得色谱图见图1。CoQ₉及CoQ₁₀的保留时间分别为9.7 min及11.9 min。以CoQ₁₀计算理论塔板数为3191，CoQ₉与CoQ₁₀的分离度为2.7。

fig 1HPLC chromatograms of blank human plasma (a), blank plasma with added CoQ₉ and CoQ₁₀ (b), volunteer plasma after oral administration of Bio-Qinon (c). 1. Coenzyme Q₁₀ (CoQ₁₀); 2. Coenzyme Q₉ (CoQ₉).4线性关系考察

取离心管数支，精密加入不同量的CoQ₁₀及新鲜血浆0.6 ml，配成相对于新鲜血浆CoQ₁₀浓度增量分别为0，0.2，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 μg·ml^-1的标准含药血浆，按“血药浓度测定”项下操作，每种浓度5份，记录峰面积。以各管中CoQ₁₀浓度增量为横坐标C，各管中CoQ₁₀与CoQ₉之峰面积比与新鲜血浆管中CoQ₁₀与CoQ₉之峰面积比(本底)的差值为纵坐标f，进行回归分析，得回归方程为f=0.8946C+0.03403<