DETERMINATION OF CORDYCEPS SINENSIS

Gong Fan (Gong F), Peng Yuangui (Peng YG), Cui Hui (Cui H), Liang Yizeng (Liang YZ),

Alexander K.M.Leung (A.K.M Leung) and Foo-tim Chau (F.T. Chau)

(College of Chemistry and Chemical Engineering, Institute of Chemometrics and Chemical Sensing

Technology, Hunan University, Changsha 410082; ¹Institute of Materia Medica, Hunan Academy

of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica, Changsha 410013; ²Departmemt of Applied

Biology and Chemical Technology, The Hongkong Polytechnic University, Kowloon, Hongkong)

ABSTRACTAIM: To simultaneously analyze the chemical components existing in the caterpillar body and stroma of Cordyceps sinensis, especially nucleosides and ergosterol, and compare the performances of several solvents used to extract nucleoside components.METHODS: To carry out qualitative and quantitative analysis by means of HPLC-DAD detection, heuristic evolving latent projections (HELP) resolution method and overall volume integration method.RESULTS: Peak purity examination and the resolution of overlapping peaks in chromatogram could be conducted by HELP method upon the two-way data and so the pure chromatogram and spectrum of each component were obtained. The recoveries were between 99.97% and 100.81%, the distributions of nucleoside components existing in caterpillar body and stroma were quite different. The performance of distilled water to extract nucleosides was the best.CONCLUSION: In comparsion with the classic one wavelength chromatography, much better qualitative and quantitative results could be obtained by HPLC-DAD and HELP resolution method.

KEY WORDShyphenated chromatographic instrument; heuristic evolving latent projections (HELP); Cordyceps sinensis

摘要目的：对冬虫夏草虫体和子座部分的甾醇和核苷类化合物进行多组分定性定量分析，并比较核苷类化合物的提取方法。方法：用HPLC-DAD联用色谱检测，借助HELP法解析，基于组分的色谱保留时间和光谱曲线进行定性，然后用总体积积分法定量。结果：HPLC-DAD联用色谱检测和HELP法解析相结合，可验证色谱峰的纯度，分辨重叠峰，得到各组分的纯色谱和光谱曲线。该法的样品回收率为99.97%～100.81%，虫体和子座部分的化学成分存在差异，用水提取核苷类化合物的效果较好。结论：综合利用色谱和光谱两方面信息，可提高组分定性定量结果的准确度。

关键词联用色谱;HELP;冬虫夏草

目前，对冬虫夏草Cordyceps sinensis子座和虫体中甾醇和核苷类等活性组分的HPLC测定一般使用常规一维色谱即单波长测定法^［1～9］，只对其中个别组分进行定性定量，且对没有完全分开的组分色谱峰常用垂直分割法等作近似处理。本文用二维HPLC-DAD联用色谱，在一段波长内检测组分，然后借助直观推导式演进特征投影(HELP)法^{［10～12］}解析所得二维矩阵数据，能够鉴定色谱峰的纯度，分辨重叠峰，得到各组分的纯色谱和光谱曲线，从而根据组分的保留时间和光谱两方面信息定性，在此基础上，再用总体积积分法进行定量^［13］。另外，对核苷类化合物采用了不同溶剂进行超声振荡提取，以比较子座和虫体部分之间及对核苷类化合物用不同的溶剂提取其化学成分的差异。

实验部分

1仪器药品

岛津LC-4A型高效液相色谱仪，岛津SPDM6A型二极管阵列紫外检测器，上海超声仪器厂CQ250型超声波清洗器。冬虫夏草(西藏产)购自长沙市九芝堂药店，经湖南省中医药研究院中药研究所彭源贵先生鉴定。麦角甾醇、腺苷和尿苷购自Sigma公司。流动相甲醇为光谱纯，其它试剂均为分析纯。

2甾醇类化合物的提取

分别称取冬虫夏草子座和虫体粉各约0.5 g，加入饱和KOH溶液2.5 ml、无水C₂H₅OH 25 ml，水浴回流1 h，皂化，放冷，用环己烷萃取3次(每次25 ml)，合并萃取液，减压浓缩至干，用无水C₂H₅OH定容至10 ml，得待测液1和2。

3核苷类化合物的提取

分别称取冬虫夏草子座和虫体粉各约0.5 g，加入蒸馏水20 ml，超声振荡2 h，滤过，滤液减压浓缩至干，用CH₃OH定容至10 ml，得待测液3和4。

分别称取冬虫夏草子座和虫体粉各约0.5 g，加入石油醚15 ml，超声振荡30 min，滤过，滤液减压浓缩至干，再加CHCl₃定容至10 ml，得待测液5和6。滤渣加入CH₃OH 15 ml,超声振荡30 min，滤过，减压浓缩滤液至干，再用CH₃OH定容至25 ml，得待测液7和8。

4色谱条件

待测液1和2的测定色谱柱:杜邦Zorbax-ODS柱(粒径5 μm,250 mm×4.6 mm,ID)；流动相:CH₃OH;流速:1.0 ml·min^-1;柱温:25℃;波长扫描范围:195～312 nm;扫描速率:0.32 s/次。

待测液3和4的测定流动相:CH₃OH—H₂O(15∶85)。

待测液5和6的测定色谱柱:杜邦Zorbax-SIL柱(粒径5 μm,250 mm×4.6 mm,ID)；流动相:CH₃OH—CHCl₃(1∶99)。

待测液7和8的测定流动相:CH₃OH—H₂O(70∶30)。

待测液3～8其余测定条件同待测液1的测定，标准对照品分别在以上对应色谱条件下测定。

结果与讨论

1虫体和子座部分中核苷类化合物提取溶剂的选择

根据文献［1］，核苷及其碱基尤其是腺苷具有较广泛的生理活性，因此核苷类化合物是虫草的重要有效成分。由文献^{［1,4,7～9］}可知，虫体和子座部分中核苷类化合物水溶性较大，而在其它溶剂中的溶解性能不很理想。本文对虫体和子座部分中核苷类化合物分别采用水超声振荡提取和先用石油醚再用甲醇超声振荡提取。结果表明，用水作溶剂，可将核苷类化合物基本提取完全，而用石油醚，几乎提取不到核苷类化合物，再用CH₃OH提取，也只有一两个主要组分，且含量很低。因此，核苷类化合物的提取用水作溶剂，超声振荡提取是可行的。

2虫体和子座部分中甾醇类化合物的提取

由文献［1］及［3］，甾醇类化合物包括甾醇及其衍生物，其中麦角甾醇是真菌类的特征甾醇，在虫草中其含量相对恒定，因此，通常将麦角甾醇作为质量控制指标之一。麦角甾醇在虫草中以游离及结合两种形式存在，为了使其提取完全，必须破坏结合型的麦角甾醇，采用饱和KOH溶液直接皂化能使麦角甾醇处于游离状态。

另外，由于利用联用色谱检测并采取一些相应的数据处理手段^{［10～12］}，即使有部分重叠峰也能较好地定性定量组分，因此，在提取分离时不必过多的分离步骤，这是联用色谱检测和多元分辨的优势之一。

3组分数的确定、色谱峰的纯度检验和重叠峰的解析及虫体和子座部分化学成分的比较

以核苷类化合物的分析为例进行说明。

经典一维HPLC法紫外检测器检测，一般选择待测组分的最大吸收或附近波长进行分析且基于组分保留时间来定性。图1-I,II分别为虫草子座(待测液3)和虫体(待测液4)中核苷类化合物在其最大吸收波长附近260 nm处的色谱曲线。从图1-I可以看出，约有12个色谱峰，且a和b峰等似是纯色谱峰，c和d峰是两组分重叠；图1-II只有9个色谱峰，在2.60～3.80 min未出现明显的色谱峰，A峰和B峰不同于图1-I中的a峰和b峰，可能是色谱峰的拖尾等所致。通过比较其它保留时间段的色谱峰，两者基本一致。特别值得注意的是，在图1-I,II中的a峰和A峰，由于其保留时间十分接近，且与腺苷标准对照品的保留时间基本一致，很可能认为a峰和A峰均是组分腺苷的纯色谱峰，而b峰和B峰也因与尿苷组分保留时间接近认为是尿苷的纯峰。

fig 1Chromatographic profiles of nucleoside components at 260 nm for stroma (I) and caterpillar body (II) of Cordyceps sinensis. The peaks marked by a～d in (I) and A～D in (II) denote possible overlapping chromatographic peaks.若采用联用色谱HPLC-DAD检测，产生在195～312 nm波长范围的矩阵数据，根据一些化学计量学多元分辨方法^{［10～13］}进行解析，获得各个组分的纯色谱和光谱曲线，通过<