PLEURISY AND ITS SELECTIVE INHIBITION BY NS-398

Yang Qiusheng(Yang QS), Harada Yoshiteru， Katori Makoto

(Capital University of Medical Science, Beijing 100054; ¹Kitasato University, Japan)

ABSTRACTAIM: To detect cyclooxygenase-2(COX-2)/prostaglandin H synthase-2(PGHS-2) in cells of pleural exudate and investigate the effect of NS-398 on its activity.METHODS: COX-2 was tested by SDS-PAGE and Western blot in cells of the pleural exudate induced in rats by intrapleural injection of 0.2 ml of 2% carrageenin. TLC was used to analyze the activity of COX-2.RESULTS: The examination using PGHS-1 or PGHS-2 antiserum showed that PGHS-2 appeared at the 5th hour after carrageenin injection, and vanished at the 19th hour. While, PGHS-1 appeared in cells before and after carrageenin injection. Furthermore, only PGHS-1, but not PGHS-2, was detected in the microsomal fraction of the lung, stomach and kidney of pleurisy-affected and normal control rats. NS-398, a novel nonsteroidal anti-inflammatory agent, suppressed the activity of COX-2 with IC₅₀=4.5μmol·L^-1.CONCLUSION: COX-2 is only present in inflammatory site induced by carrageenin. NS-398 may selectively inhibit COX-2 activity in a dose-dependent manner.

KEY WORDScyclooxygenase-2(prostaglandin H synthase-2)； pleurisy； Western blot; N-(2-cyclohexyloxy-4-nitrophenyl) methane sulfonamide

摘要目的：检测角叉菜诱导的大鼠胸膜炎渗出细胞中COX-2的存在并观察NS-398对其活性的影响。方法：用SDS-PAGE和Western blot分析及PGHS-1和PGHS-2抗血清，识别并检测胸膜炎渗出细胞中的COX-2。酶活性用TLC法测定。结果：致炎后5 h, PGHS-2出现, 19 h时消失，而PGHS-1在注射角叉菜前后均出现。此外，在胸膜炎大鼠和正常大鼠的肺、胃、肾微粒体中，只检测到PGHS-1, 未检测到PGHS-2。新的非甾体抗炎药NS-398,可明显抑制COX-2活性（IC₅₀=4.5 μmol·L^-1 ）。结论：COX-2仅存在于角叉菜诱导的炎症部位；NS-398可选择性抑制COX-2，并呈剂量依赖性。

关键词环氧酶-2（前列腺素H合成酶-2）; 胸膜炎; 免疫印迹; NS-398［N-(2-环己氧-4-硝基苯)甲烷磺胺］

环氧酶(COX)或称前列腺素H合成酶(PGHS)是花生四烯酸(AA)代谢、前列腺素(PGs)和血栓素A₂(TAX₂)生物合成过程中重要的限速酶之一。最近的研究发现：COX有两种形式: COX-1，即通常所指的环氧酶，存在于大多数组织细胞中，而它的异构体COX-2，是一种被诱导的酶，仅存在于多种刺激因子如PMA,LPS和IL-1等引起的炎症组织中^［1，2］，并在一些组织中证实有COX-2 mRNA的存在^［3，4］,然而在实验动物炎症模型上证据极少。因此为了证实炎症组织中COX-2的存在，我们以大鼠胸膜炎模型检测了COX-2的生成并在体外观察了NS-398对两种酶催化的AA代谢产物PGE₂的影响。

材料和方法

1大鼠胸膜炎渗出细胞、肺、胃、肾微粒体的制备及免疫印迹分析(Western blot analysis)

Sprague Dawley（SD）大鼠(♂，9～10周龄)，胸膜炎组胸膜腔内注射2%角叉菜0.2 ml，对照组注射等量生理盐水(n=6)。在一定时间内乙醚吸入麻醉断头处死, 收集胸腔渗出液，细胞分离后悬浮于20 mmol·L^-1 Tris-HCl缓冲液（pH 7.4，含色氨酸5 mmol·L^-1）中，经超声震荡5 min将细胞破碎，于700×g离心10 min，4℃。取上清液加入0.5% Tween 20， 140 000×g离心1 h,4℃,沉淀部分悬浮于20 mmol·L^-1 Tris-HCl缓冲液于-20℃保存备用。

分离大鼠肺、胃及肾，分别用100 mmol·L^-1 Tris-HCl缓冲液制成匀浆。在12 000×g离心20 min,取上清液于100 000×g离心1 h,4℃。沉淀部分按前述方法悬浮保存。所有操作均在4℃下进行。用Bio-Rad蛋白分析法(Bio-Rad Co.美国)测定制备样品中蛋白含量，分别加样10 μl(50～75 μg/lane),进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, 简称SDS-PAGE)^{［5 ］}。开始电流10 mA, 30 min。当待测样品进入分离胶后将电流调至20 mA, 30 min。电泳展开后转移到Immobilon-P纤维膜(Millipore Co.日本)上，用Block Ace(大日本制药）封闭后，与PGHS-1和PGHS-2（Calyman Chem美国)抗血清反应。再与羊抗兔IgG作用。以70-ku分子标记蛋白(Molecular mark protein，LKB，瑞典）定位^［6］，进行蛋白印迹分析^［7］。免疫染色的具体步骤按厂家(Konica Co.日本)试剂说明书进行。

2体外AA代谢产物的TLC分离和放射性强度测定

将COX-1和COX-2(Calyman Co.美国)分别加入50 mmol·L^-1 Tris-HCl缓冲液中，其中含血红蛋白1 μmol·L^-1和色氨酸5 mmol·L^-1。在此反应系统中加入不同浓度吲哚美辛（Merck Co.)和NS-398［N-(2-cyclohexyloxy-4-nitrophenyl)methane sulfonamide, Taisho制药，日本］，以等量缓冲液为对照, 于37℃温育4 min。然后加入³H-AA(74 kBq*ml^-1) 20 μl继续反应2 min。用1 mol·L^-1 HCl终止反应，经乙酸乙酯提取2次。合并提取液经旋转蒸发后溶于乙酸乙酯中进行TLC分离（20 cm×20 cm硅胶板，Whatman Co.美国)。展开剂为乙酸乙酯—异辛烷—乙酸—水(90∶50∶20∶100)。经γ-放射色谱摄影仪定位后将样品分别刮下,加入ASC-II闪烁液6 ml进行放射性强度测定。以产物PGE₂生成量，计算药物对COX-1和COX-2活性的抑制作用。抑制率（%）=(对照放射性计数-给药放射性计数)/对照放射性计数×100%。

实验数据经统计学t-检验处理。

实验结果

1大鼠胸腔渗出细胞及肺、胃、肾微粒体的免疫印迹分析

胸腔渗出细胞免疫印迹图谱如图1所示。按文献^［6］报道, 70 ku标准分子量蛋白质，与人的PGHS-1和PGHS-2的分子量相似。本实验中，正常大鼠胸腔渗出细胞中只有PGHS-1蛋白染色区带,其存留在5 h和19 h保持于同一水平。而在角叉菜诱导的大鼠胸膜炎渗出细胞(92%为多形核白细胞，少量单核细胞)，致炎前无PGHS-2区带, 致炎后5 h出现, 19 h消失。这与培养的人脐索静脉内皮细胞中所测结果^［8］相一致。以前的实验^［9］证实：角叉菜致胸膜炎1～7 h, PGE₂和TXB₂明显升高并可被阿斯匹林抑制。PGHS-2印迹的时间过程与胸膜炎渗出细胞中PGs水平相吻合。图2显示：PGHS-1染色区带存在于正常大鼠和胸膜炎5 h后大鼠的肺、胃、肾中，而在这些组织中PGHS-2区带均未出现，明显低于检测水平，这表明即使动物有炎症感染时,PGHS-2(COX-2)也仅存在于炎症部位，而不存在于感染动物的其它组织。

Fig 1Immunoblot analysis of pleural cells. lane 1: pleural lavage cells from normal rats; lane 2: pleural exudate cells at 5 h of pleurisy; lane 3: pleural exudate cells at 19 h of pleurisy. The position of 70-ku molecular marker protein is indicated.

Fig 2Immunoblot analysis of microsomal fractions of the lung(lane 1), stomach(lane 2) and kidney(lane 3). Panel A, from normal control rats; panel B, from rats of 5 h of pleurisy. The position of 70-ku molecular marker protein is indicated.

2NS-398对AA代谢产物的影响

在环氧酶作用下，AA代谢产物主要为6-keto-PGF_1α, PGE₂和PGD₂。给药后3种产物的生成都受到不同程度抑制，仅以与炎症密切相关的PGE₂作图(图3)。结果表明：在体外NS-398可明显抑制COX-2，并呈剂量依赖性，IC₅₀=4.5μmol·L^-1。 相同剂量对COX-1的影响很小, 剂量增至100 μmol·L^-1时，对COX-1的抑制率约为30%。在本实验剂量范围内，未得出IC₅₀。说明NS-398对COX-2的抑制作用具有较强选择性。 吲哚美辛对COX-1和COX-2活性的抑制程度近似, IC₅₀分别为0.75μmol·L^-1和1 μmol·L^-1。