FOCAL CEREBRAL ISCHEMIA RATS

Xu Haoliang(Xu HL) and Feng Yipu(Feng YP)

(Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and

Peking Union Medical College, Beijing 100050)

ABSTRACTAIM: To study the effects of dl-, l- and d-3-n-butylphthalide(NBP) on pial arteriole diameter(AD) and blood flow velocity(BFV) in focal ischemia rats.METHODS: Urethane-anesthetized rats were instrumented for monitoring pial AD and BFV in the cranial window preparation. The effects of dl-, l-, d-NBP on AD and BFV were investigated in these left middle cerebral artery occluded(L-MCAO) rats by using the method of acute cranial window technique under in vitro videomicroscope. dl-,d-,l-NBP(25 mg·kg^-1 ip) and nimodipine(0.3 mg·kg^-1) were administrated systemically 20 min after MCAO or 1 h before MCAO.RESULTS: In the vehicle group, MCAO induced a significant decrease in BFV and AD, the levels of BFV and AD were reduced to 18.3% and 52% compared with the preischemia baseline values. In the pretreatment groups, no change in pial AD was found after dl-, l-, d-NBP administration in normal animals, and a rapid and marked decrease in BFV and AD of the selected pail artery was observed within 5 minutes after MCAO. The decreased level of AD and BFV recovered quickly after MCAO in the dl-, l-NBP and nimodipine groups, while the dysfunction of microcirculation was exacerbated by d-NBP. In the post-treatment groups, dl-NBP(12.5, 25 mg·kg^-1 ip) induced dilation of the pial arterioles and the increase in BFV was in dose-dependent manner. The pial arteriolar response to MCAO was not affected by d-NBP and nimodipine.CONCLUSION: These data suggest that the improving effects of dl- and l-NBP on microcirculation dysfunction during ischemia may play an important role in their protective effects against focal cerebral ischemia injury. l- and d-NBP showed counteractive effects on pial AD and BFV in MCAO rats indicating that NBP has stereoselective character on its protective action against cerebral ischemia injury.

KEY WORDS3-n-butylphthalide; nimodipine; focal cerebral ischemia; pial arteriole; microcirculation

摘要目的：观察消旋、左旋及右旋丁基苯酞（dl-，l-，d-3-n-butylphthalide，dl-，l-，d-NBP）对局灶性脑缺血大鼠软脑膜微循环障碍的影响。方法：用插线法造成大鼠局灶性脑缺血模型，并用体外显微摄像技术及微循环图象处理系统观察大鼠软脑膜微动脉管径及红细胞流速的变化。结果：dl-,l-和d-NBP对正常大鼠脑微动脉管径无明显影响，MCAO术前1 h预防给药，dl-,l-NBP和尼莫地平可明显增加局灶性脑缺血大鼠软脑膜微动脉管径及血流速度，而d-NBP则加重软脑膜微循环障碍。MCAO术后20 min治疗给药，dl-和l-NBP仍可明显逆转局灶性脑缺血大鼠软脑膜微循环障碍，而d-NBP及尼莫地平作用不明显。结论：改善脑微循环状态是 dl-和l-NBP发挥抗脑缺血作用的重要药理机制之一。

关键词丁基苯酞； 尼莫地平； 局灶性脑缺血； 软脑膜微动脉； 微循环

经多年研究表明，本室研制开发的一类新型抗脑缺血药物丁基苯酞（NBP），有调节脑缺血状态下脑能量代谢^［1］、增加缺血区脑血流量^［2］、缩小脑梗塞面积、减轻脑水肿^［3］、改善脑缺血后神经功能缺损症状的作用。由于急性脑缺血时,首先出现脑微循环障碍,脑血流量降低,并继发脑能量代谢失调,导致脑组织坏死,神经功能缺损及缺血后炎症的发生,所以,研究NBP对脑微循环及脑组织血流状况的影响有十分重要的意义。最近，本研究组用氢清除法研究了NBP对局灶性脑缺血大鼠纹状体血流量的影响,发现dl-NBP对治疗和预防MCAO引起的脑缺血区血流量下降有良好的改善作用,且作用持续时间比尼莫地平长。由于氢清除法测定脑血流量是对局部脑组织循环状态的间接反映,故本实验通过监测NBP对MCAO后大鼠软脑膜微血管管径及血流速度的影响,用较直观的方法，研究其对脑微循环障碍的作用,并对NBP的各种旋光异构体分别进行分析评价。在脑缺血时，脑微循环障碍是导致神经细胞损伤的主要病理基础之一，所以本研究通过观测NBP对MCAO后软脑膜微循环的影响，进一步分析其抗脑缺血的药理作用机制。

材料与方法

药品和仪器消旋，左旋，右旋丁基苯酞（dl-，l-，d-NBP）由中国医学科学院协和药厂提供，纯度＞96%，dl-，l-和d-NBP旋光度依次为0，-69.73和+64.08度，临用前分别用0.5% Tween-80配制成所需浓度；尼莫通（Nim，含nimodipine 2 mg·ml^-1）购自拜耳公司（德国）。显微摄像系统及微循环处理软件（微循环显微镜、监视器、摄像头、录像机、自动计时器、图像处理板及MCIP软件）由国营江南光学仪器厂提供。

动物体重230～260 g ♀ Sprague-Dawley大鼠，由江苏省实验动物中心提供。

软脑膜微循环的观测^［3］实验时，室温控制在20～25℃。用乌拉坦（1.0 g·kg^-1 ip）麻醉大鼠,沿颅骨正中线和耳上方连线做一“T”形切口,暴露左侧颅骨,在离矢状窦约2～3 mm处,用手术刀刮薄并去除骨质,形成一直径为0.6 cm的卵圆形窗口,小心剥离硬脑膜、蛛网膜、暴露软脑膜,以39℃的人工脑脊液(mmol·L^-1: NaCl 124.0, KCl 3.3, KH₂PO₄ 1.2, NaHCO₃ 26.0, CaCl₂ 2.5, MgSO₄·7H₂O 2.4, D-葡萄糖 10.0)保持软脑膜湿润,并用白炽灯维持其颅温于37℃。通过监视器选取管径40～70 μm的微动脉进行观察摄像，并用MCIP软件测定其红细胞流速（blood flow velocity, BFV）及管径（arteriole diameter, AD）的变化。

MCAO模型制备大鼠仰卧位固定，沿颈正中线切开，分离颈外动脉、颈内动脉，将直径为0.26 mm的尼龙线自颈外动脉，经颈内动脉插入颅内,沿颅内动脉进入约2 cm,此时线头已达大脑中动脉起始部,造成MCAO脑缺血模型。

实验动物分组大鼠随机分为假手术组(尼龙线自颈外动脉插入约1.0 cm)，溶剂对照组（ip 0.5% Tween-80 1 ml·kg^-1）, Nim给药组(ip Nim 0.3 mg·kg^-1)，dl-NBP, l-NBP及d-NBP给药组（分别ip dl-NBP，l-NBP，d-NBP 12.5, 25 mg·kg^-1)。所有动物根据给药时间分为：预防给药组（MCAO术前1 h给药）和治疗给药组（MCAO术后20 min给药）。

统计学分析所有实验结果均以±s表示，并以组间t检验，分析其差异显著性。

结果

1dl-，d-,l-NBP及Nim治疗给药对软脑膜微动脉BFV的影响

MCAO术后20 nim,软脑膜微动脉BFV显著降低,约为术前的6%～27%,溶剂对照组,BFV持续波动于正常水平的15%左右。dl-NBP 12.5及25 mg*kg^-1可剂量依赖性地增加BFV,且于给药后15 min即有明显的效果,45～60 min时,效果最为显著,于给药后90 min仍保持较高水平，l-NBP(25 mg·kg^-1)作用强度与同剂量的dl-NBP相似。d-NBP 25 mg·kg^-1或Nim 0.3 mg·kg^-1对MCAO后软脑膜微动脉BFV无明显作用（图1）。

fig 1Effects of NBP and Nim given 20 min after ischemia on cerebral blood flow velocity in MCAO rats. Values are ±s, n=5. ^*P＜0.05, ^**P＜0.01, ^***P＜0.001 compared with the vehicle group. ◇—◇ Vehicle; □—□ Nim; ○—○ dl-NBP 12.5 mg·kg^-1; ■—■ dl-NBP 25 mg·kg^-1; △—△ l-NBP 25 mg·kg^-1; ●—● d-NBP 25 mg·kg^-1.

2dl-，d-,l-NBP及Nim治疗给药对软脑膜微动脉AD的影响

假手术组软脑膜微动脉AD无明显变化。MCAO术后，溶剂对照组AD明显下降，且持续波动于正常AD水平的46%～59%之间。 ip dl-NBP 12.5， 25 mg·kg^-1后30 min，AD呈剂量依赖性地明显增加，且作用持续较长时间。l-NBP 25 mg·kg^-1亦能明显扩张微动脉，其作用于给药后45～60 min达峰值，与同剂量的dl-NBP相似。d-NBP及Nim则对MCAO后AD无明显作用（图2）。

Fig 2Effects of NBP and Nim given 20 min after is