摘要目的：研究叶酸的光化学行为并提出测定叶酸的光化学荧光分析方法。方法：叶酸在六次甲基四胺-盐酸介质中,经365 nm紫外光照射后，发生光化学反应，产物的荧光强度(λ_ex 280 nm,λ_em 443 nm)较叶酸本身的增大了25倍。根据光化学反应产物的荧光强度测定叶酸的含量。结果：叶酸的浓度在1.0×10^-5～1.0×10^-7 mol^.L^-1范围内，荧光强度与浓度呈良好的线性关系，检出限为1.5×10^-9 mol^.L^-1，相对标准偏差为1.6%。结论：本方法适用于片剂中叶酸的测定。

PHOTOCHEMICAL BEHAVIOUR OF FOLIC ACID AND ITS APPLICATION

Zhao Huichun(Zhao HC), Zhang Tianlei(Zhang TL), Zhang Tieli(Zhang TL) and Feng Ruiqin(Feng RQ)

(Department of Chemistry, Beijing Normal University, Beijing 100875)

ABSTRACTAIM: To study the photochemical behaviour of folic acid and establish a photochemical fluorimetric method for folic acid determination.METHODS: In (CH₂)₆N₄-HCl medium, a photochemical reaction takes place on irradiation of the folic acid with 365 nm ultravident light. The photochemical product showed an intense fluorescence intensity (λ_ex 280 nm, λ_em 443 nm), which was 25 times higher than that of the original folic acid. On this basis, the determination of folic acid was carried out.RESULTS: The linear relationship between the fluorescence intensity and concentration of folic acid is over the range of 1.0×10^-7～1.0×10^-5 mol·L^-1, the detection limit is 1.5 nmol·L^-1 and relative standard deviation is 1.6%. The recoveries are in the range of (99.5～106.5)%.CONCLUSION: It can be applied to the determination of folic acid in tablets.

KEY WORDSphotochemical fluorimetry; folic acid

叶酸（folic acid）亦称维生素Bc，蝶呤的衍生物，其分子由蝶啶、对氨基苯甲酸及谷氨酸组成，是抗贫血药，主要用于巨幼红细胞性贫血，也可用于恶性贫血的辅疗药物。本品在人体内参与氨基酸及核酸的合成，并能与维生素B₁₂共同促进红细胞的生成。

用高效液相色谱法^［1,2］、分光光度法^［3］、吸附溶出伏安法^［4］、微生物放射法^［5］、荧光衍生法^［6,7］测定叶酸的含量已见报道，但用光化学荧光法测定叶酸的含量至今未见报道。叶酸稀溶液的荧光较弱，直接荧光法测定灵敏度很低，但叶酸在六次甲基四胺-盐酸介质中经紫外光照射后，荧光强度增大了25倍，极大地提高了荧光法测定的灵敏度。此法突出的特点是简便、无需外加试剂、稳定性及重现性好、灵敏度高。

实验部分

仪器及试剂日立850荧光分光光度计,岛津UV-250紫外分光光度计，pHS-2型酸度计（上海第二分析仪器厂），ZF-I型三用紫外分析仪（上海顾村电光仪器厂）。

叶酸（中国药品生物制品检定所）标准溶液（1.00 mmol^.L^-1）：称取纯叶酸44.14 mg加0.10 mol^.L^-1 NaOH溶液数滴溶解，于100 ml量瓶中定容。避光(0～4℃)冷藏保存。使用时用水逐级稀释为所需浓度。试剂均为分析纯，水为二次重蒸水。

实验方法取适量叶酸标准溶液于10 ml具塞刻度试管中，加入0.2 mol^.L^-1 (CH₂)₆N₄—HCl缓冲溶液(pH 5.2) 1.0 ml，用水稀释至10 ml，摇匀。在365 nm(辐照度为30 mW^.cm^-2)紫外光下照射40 min后，放置10 min。在激发波长为280 nm、发射波长为443 nm、激发通带和荧光通带分别为8 nm和10 nm条件下，以试剂为参比测定其相对荧光强度。

结果

1吸收光谱及荧光光谱

叶酸体系的吸收光谱和荧光光谱如图1和图2所示。

由吸收光谱（图1）可见，叶酸本身在240 nm，280 nm，350 nm有3个吸收峰。当加入(CH₂)₆N₄-HCl缓冲溶液后其240 nm的吸收峰消失，且经紫外光照射后，280 nm处吸收峰明显降低，365 nm处吸收峰略有紫移且峰强度有所升高，可见光照后体系发生了化学反应。由图2可见，体系的激发光谱和吸收光谱相似，光照与不光照体系的荧光光谱峰位基本不变，但叶酸在(CH₂)₆N₄-HCl介质中光照后，体系的荧光强度大大提高了。叶酸浓度为1.0×10^-5～1.0×10^-7 mol^.L^-1时，光照与不光照体系的荧光强度相差25倍，说明光照后有强荧光物质生成。测定时选择激发波长为280 nm、荧光波长为443 nm，测定光照体系的荧光强度。

Fig 1Adsorption spectra of folic acid. Concentration of folic acid: 1.0×10^-5 mol^.L^-1. a. Folic acid, no irradiation; b. Folic acid+(CH₂)₆N₄-HCl, no irradiation; c. Folic acid, with irradiation; d. Folic acid+(CH₂)₆N₄-HCl, with irradiation.

Fig 2Excitation and emission spectra of folic acid. Concentration of folic acid: 1.0 μmol^.L^-1. a,a'. Folic acid, no irradiation; b,b'. Folic acid+(CH₂)₆N₄-HCl, no irradiation; c,c'. Folic acid, with irradiation; d,d'. Folic acid+(CH₂)₆N₄-HCl, with irradiation.

2酸度及缓冲溶液的选择

试验了pH 2～10不同缓冲体系HCl，HAc-NaAc，(CH₂)₆N₄-HCl，NH₄Ac-NH₃,NH₄Ac,Na₂HPO₄-NaH₂PO₄和Na₂B₄O₇-NaOH对叶酸荧光强度的影响。发现，只有在(CH₂)₆N₄-HCl介质中叶酸经光照后其荧光强度才明显增大。实验选用(CH₂)₆N₄-HCl缓冲体系来控制溶液的pH值。pH值对荧光强度的影响如图3所示。由图可见，pH 5～6时荧光强度值大且稳定。实验时选择pH 5.2的(CH₂)₆N₄-HCl缓冲介质，确定其用量以1.0 ml为宜。

3光照时间的影响

将配好的溶液避光放置2 d，荧光强度变化很小。同样的溶液在日光下放置时，发现随放置时间的增长荧光强度逐渐增大。将其置于365 nm(辐照度为30 mW^.cm^-2)紫外灯下照射，荧光强度随时间变化的关系曲线如图4所示。由图可见，光照40 min后荧光强度趋于平稳，而且放置50 h后其荧光值基本不变，故实验时选择光照时间为40 min。

Fig 3Effect of pH of buffer solution on relative intensity. Concentration of folic acid: 1.0 μmol^.L^-1.

Fig 4Effect of irradiation time on relative intensity. Concentration of folic acid: 1.0 μmol^.L^-1 (irradiation intensity: 30 mW^.cm^-2).

4干扰试验

以误差5%为限，100倍的V_B1和20倍的Al³⁺及Zn²⁺等常见离子对测定无干扰，Vc对叶酸的测定有严重的干扰。

5工作曲线

叶酸浓度为1.0×10^-7～1.0×10^-5 mol^.L^-1荧光强度ΔF与浓度C(mol^.L^-1)呈良好的线性关系。当叶酸浓度为1.0×10^-7～1.0×10^-6 mol^.L^-1时，其线性回归方程为：

ΔF=0.0229+3.24×10⁶C，γ=0.9998

当叶酸浓度为1.0×10^-6～1.0×10^-5 mol^.L^-1时，其线性回归方程为:

ΔF=0.0788+3.