摘要目的： 商陆皂苷甲(EsA)对大鼠Heymann肾炎(passive Heymann nephritis，PHN)的治疗作用及机理。方法： 大鼠sc Fx1A抗原的抗体制成自身免疫性肾小球肾炎，EsA 5,10和20 mg·kg^-1.d^-1 ip，连续14 d。结果： EsA可以显著减少肾炎大鼠尿蛋白的产生，电镜和免疫荧光检查发现EsA治疗后肾炎大鼠病理情况明显好转。EsA治疗对血清中炎性细胞因子肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素1（IL-1）和白细胞介素6（IL-6）的产生具有显著的抑制作用。结论： EsA对大鼠Heymann肾炎具有显著治疗作用，抑制细胞因子产生可能参与EsA抗炎机制。

THERAPEUTIC EFFECTS OF ESCULENTOSIDE A ON PASSIVE HEYMANN

NEPHRITIS IN RATS AND ITS INHIBITION ON CYTOKINE PRODUCTION

Ju Dianwen(Ju DW), Zheng Qinyue(Zheng QY)¹, Cao Xuetao(Cao XT),

Mei Xiaobin(Mei XB) and Yi Yanghua(Yi YH)¹

(Department of Immunology, ¹School of Pharmacy,

Second Military Medical University, Shanghai 200433)

ABSTRACTAIM: To investigate the therapeutic effects of esculentoside A, a kind of saponin isolated from the root of the Chinese herb Phytolaca esculenta, on passive Heymann nephritis (PHN) in rats.METHODS: PHN was prepared by injecting Fx1A antibody in rats, and esculentoside A 5, 10 and 20 mg·kg^-1 were administered intraperitonealy once a day for 14 consecutive days for the treatment of PHN rats.RESULTS: Esculentoside A 5, 10 and 20 mg·kg^-1 decreased urine protein production significantly. Pathological analysis revealed that deposits of IgG along the capillary wall of the glomerulus, glomerulus base membrane thickness and electron-dense deposits in PHN rats after treatment with esculentoside A were less than those in control rats. Decreased levels of TNF, IL-1 and IL-6 were observed in the sera of PHN rats following esculentoside A administration. TNF, IL-1 and IL-6 are important cytokines involved in the pathogenesis of inflammatory lesions.CONCLUSION: Esculentoside A possessed potent anti-inflammatory effects on PHN. Inhibition of inflammatory cytokine production may partially explain the anti-inflammatory effects of esculentoside A.

KEY WORDSesculentoside A; passive Heymann nephritis; tumor necrosis factor; interleukin 1; interleukin 6

商陆皂苷甲(esculentoside A, esA)是从中国商陆(Phytolacca esculenta van Houtte)的块根中提取的一种三萜皂苷化合物^［1］，我们在以往实验中发现，EsA有很强的抗炎作用，对急性渗出性炎症，肉芽肿增生的慢性炎症及其他一些炎症模型都有明显抑制作用^［2］。本试验观察了EsA对大鼠Heymann肾炎(PHN)的治疗作用, 并初步探讨了其作用机理。

材料和方法

药品与试剂EsA纯度大于98％，用磷酸缓冲液（PBS）溶解。福氏完全佐剂(CFA)，RPMI-1640培养基，Con A, 白细胞介素1（IL-1），白细胞介素6（IL-6），肿瘤坏死因子（TNF）, 放线菌素D购自Sigma公司。³H-TdR购自上海原子核研究所，比活841 TBq·mol^-1。

动物新西兰兔，(2.5±0.3) kg，♂；Spague-Dawley大鼠，(300±20) g,♂，由中英合资上海SIPPR-BK实验动物有限公司提供。

大鼠Heymann肾炎模型的制备♂大鼠，麻醉后仰卧位固定，取腹部正中切口，用4℃含肝素磷酸缓冲液（PBS）灌注肾脏，取下肾脏，低温下分离肾实质，过150目不锈钢筛网，收集滤液，4℃离心(400×g，9 min)，弃沉淀，上清液再离心3次，至上清液无沉淀，上清液超速离心(70 000×g，45 min)弃上清

液，吹打沉淀，反复洗涤3次，最后沉淀物即为近曲小管刷状缘抗原Fx1A, 冷冻干燥，保存在-30℃。

♂新西兰兔，用等量CFA乳化Fx1A抗原，皮下多点注射，每周2次，共6次，放血制成血清，测效价为1∶64，按1 ml·100 g^-1剂量从尾静脉注射给雄性大鼠，一周后出现蛋白尿，14 d后大鼠分为5组，3组分别给EsA 5,10和20 mg·kg^-1，一组给地塞米松(DXM) 1 mg·kg^-1，一组给生理盐水作为对照组，治疗14 d后处死，取血清及肾标本^［3］。

尿蛋白观察用磺基水杨酸比浊法，收集大鼠24 h尿液，测定500 nm处A值，按标准曲线Y=-0.0035+0.3078X， γ=0.9965, 换算成尿蛋白含量(mg·L^-1)，以治疗后与治疗前相比较尿蛋白减少表示。

免疫荧光检查(IF)用荧光素标记的羊抗兔IgG,兔抗鼠IgG在冰冻切片(厚4 μm)上直接做IF检查，观察兔IgG、大鼠IgG在肾小球内的沉淀和分布情况。

电镜检查肾组织标本切成1 mm³组织块，先后经0.25%多聚甲苯-0.2%戊二醛混合液和1%锇酸固定，经70%醋酸钠乙醇溶液及环氧丙烷处理，包埋定位切片，染色后用JEM100SX透射电镜观察。

血清TNF的生物测定采用L929作为靶细胞的结晶紫染色法测定TNF。将传代培养的L929细胞按2×10⁴/孔接种到96孔培养板上，培养24 h后加入含有10%FCS的RPMI-1640培养基稀释的TNF样品和放线菌素D(1 μg·ml^-1), NaF 2 mmol·L^-1，继续培养18 h后弃去上清液，将培养板浸入结晶紫染液中染色20 min，洗去未被细胞掺入的染料，室温干燥，每孔加入0.1 ml结晶紫提取液，振荡后用酶联仪于595 nm处测定各孔吸光度值A，将A与log 2样本稀释倍数作线性回归，并由此计算出A值为对照孔(只加放线菌素D和NaF)A值一半时样本的稀释倍数(50%杀伤时的稀释倍数)定为样本的TNF单位数^［4］。

血清IL-1的诱生与检测IL-1的测定采用小鼠胸腺细胞增殖法。以样本1∶32稀释度时刺激2.5 μg·ml^-1 ConA诱导的小鼠胸腺细胞增殖时³H-TdR的掺入值表示IL-1的生物活性^［5］。

血清IL-6的生物测定IL-6的测定采用IL-6依赖性的细胞株B9。细胞用含有10%FCS，重组IL-6的RPMI-1640培养基传代培养，2～3 d传代1次。传代后d 2离心(1 000 r·min^-1, 10 min)收集细胞，用RPMI-1640洗涤3次，调整细胞浓度至10^4.ml^-1，按每孔0.1 ml加至96孔板上，同时加入标准IL-6或待测样本上清液，于37℃，5% CO₂, 饱和温度条件下培养60 h，每孔加入³H-TdR 1.85×10³ Bq，继续孵育12 h后用多差别细胞收集仪将细胞收集在纤维滤纸上，烘干，加入闪烁液并在液闪计数仪上测定³H-TdR的掺入值。以cpm值大小表示IL-6的活性高低^［6］。

实验结果以±s表示，显著性测定用t检验。

实验结果

1EsA对尿蛋白变化

图1结果显示，对照组PHN大鼠治疗后尿蛋白的含量与治疗前相比较增加了35.8 mg·L^-1.d^-1，EsA 5,10和20 mg·kg^-1 ip，qd，连续14 d可呈剂量依赖性地明显降低尿蛋白的含量(P＜0.01)，DXM 1 mg·kg^-1也能明显降低尿蛋白的产生(P＜0.01)。

fig 1Effects of esculentoside A (EsA) 5，10，20 mg·kg^-1 ip on the reduction of urine protein production in passive Heymann nephritis(PHN) rats. n=10, ±s. ^*P＜0.05, ^**P＜0.01 compared with control group. DXM: Dexamethasene.

2免疫荧光与电镜分析

免疫荧光镜检结果显示，PHN大鼠IgG沿肾小球毛细血管袢呈弥漫，颗粒状沉淀，荧光较强（+++），EsA 10 mg·kg^-1 qd，连续治疗两周后，荧光明显降低（＋）。电子显微镜结果表明，PHN大鼠可见肾小球基底膜上及皮下电子致密物沉积，肾小球基底膜不规则增厚(图2A)， EsA 10 mg·kg^-1治疗组大鼠病理改变有明显减轻(图2B)。

Fig 2Thickness of glomerular basement membrane and electron-dense deposits in passive Heymann nephritis(PHN) rat (A) and in PHN rats after esculentoside A (EsA) 10 mg·kg^-1 ip (B). EM×20 000.<