摘要目的： 研究海南哥纳香醇甲（GHM-10）抑癌细胞DNA合成的作用机制。方法： 用单细胞凝胶电泳法检测GHM-10对L1210细胞DNA分子的损伤，碱洗脱法测定GHM-10对L1210细胞DNA单链长度的影响，用GHM-10对超螺旋pUC18 DNA的解旋能力测定它对DNA拓扑异构酶II活性的影响。结果： L1210细胞用GHM-10 (4～10) μg·ml^-1处理4.5 h后，DNA分子受损，表现为电泳后在荧光显微镜下可见彗星状拖尾。GHM-10 (4～25) μg·ml^-1处理L1210细胞5 h, 可引起DNA单链断裂。 L1210细胞或从L1210细胞分离的蛋白质在用GHM-10处理后，DNA拓扑异构酶II的活性均被抑制。结论： GHM-10可引起L1210细胞DNA分子损伤； 无论在细胞内还是细胞外，GHM-10可抑制拓扑异构酶II的活性。

EFFECT OF HOWIINOL(GHM-10) ON THE STRUCTURE

OFDNA MOLECULES AND ACTIVITY OFDNA TOPOISOMERASE II

IN L1210 CELLS

He Jianhua(He JH) and Xu Chengxiong(Xu CX)

(Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and

Peking Union Medical College, Beijing 100050)

ABSTRACTAIM: To study the mechanism of inhibitory action of howiinol A(GHM-10) on synthesis of DNA in cancer cells.METHODS: Single cell gel electrophoresis was used to detect the DNA molecular damage induced by GHM-10 in L1210 cells. Alkaline elution technique was used to investigate the effect of GHM-10 on the length of DNA strands of L1210 cells. Dehelix effect of GHM-10 on superhelix pUC 18 DNA was used to estimate its influence on the activity of DNA topoisomerase II.RESULTS: After L1210 cells were treated with 4 and 10 μg·ml^-1 of GHM-10 for 4.5 h, comet like tails could be seen in cells under a fluorescence microscope after electrophoresis, indicating that DNA damage was induced by GHM-10. DNA single strand breaks were demonstrated when L1210 cells were treated with GHM-10 in concentrations of 4 and 25 μg·ml^-1 for 5 h. When L1210 cells or protein isolated from L1210 cells were treated with GHM-10, the activity of DNA topoisomerase II was inhibited.CONCLUSION: GHM-10 induces damage to DNA molecules in L1210 cells and inhibits the activity of topoisomerase II both inside and outside the cells.

KEY WORDSanticancer drugs; howiinol A(GHM-10); DNA damage; DNA topoisomerase II

海南哥纳香醇甲（GHM-10）是从海南哥纳香(Goniothalamus howii) 中分离得到的一种新化合物。前期研究表明： GHM-10在体内外对癌细胞均有较强的细胞毒作用，这种作用有非时相特异性的特点^［1］； L1210细胞在体外用GHM-10处理后，DNA，RNA和蛋白质的生物合成均出现明显抑制，其中以DNA合成的抑制最显著^［2］； 虽然L1210细胞在用GHM-10处理1 h后DNA合成的抑制已不可逆，但GHM-10不能与小牛胸腺DNA形成复合物，也不能直接破坏DNA的结构^［3］。为了进一步探讨GHM-10使DNA产生不可逆损伤的机制，本文用单细胞电泳法、DNA碱洗脱法和酶测定法等研究了GHM-10对DNA分子结构和拓扑异构酶II活性的影响。

材料和方法

细胞小鼠白血病L1210细胞培养于含10%新生牛血清的RPMI 1640培养基(GIBCO出品)中，在含5% CO₂的37℃温箱中培养，每3 d传代1次。

药品GHM-10由本所植化室于德泉教授提

供，分子质量380，不溶于水，以DMSO配制，4℃保存，实验前用培养基稀释至所需浓度。

单细胞凝胶电泳法检测GHM-10对L1210细胞的DNA损伤^［4］取对数生长期L1210细胞配成浓度为1×10⁶个·ml^-1的细胞悬液，分装3瓶，于接种同时加入GHM-10 4及10 μg·ml^-1，对照组给予等剂量溶剂，于37℃，5% CO₂中培养4.5 h，冰浴终止反应，收集细胞，用冷PBS洗涤两遍，细胞沉淀用0.5 ml冰冷的PBS悬起。

吸取1%琼脂200 μl均匀涂布于载玻片上，于冰上成胶，再将细胞悬液于37℃条件下与1%低熔点琼脂糖（Sigma产品）按1∶3混匀，迅速涂布于已成胶的底层琼脂上，再于冰上成胶，将固定好的细胞凝胶玻片浸于细胞溶解液(NaOH 0.03 mol·L^-1, NaCl 1 mol·L^-1)中40 min，取出用蒸馏水慢慢冲洗，淋干，再浸入解旋液（NaOH 0.3 mol·L^-1, EDTA 1 μmol·L^-1）中8 min，取出用双蒸水冲洗，将玻片水平放入电泳槽（DF-C型恒压恒流电泳仪，北京东方仪器厂产品）中，于45 V电压下电泳13 min，用EB(ethidium bromide)染色10 min。操作尽量避光，在反射式荧光显微镜下观察照相。

碱洗脱法测定GHM-10对DNA单链长度的影响^［5］取对数生长期L1210细胞，配成浓度为3×10⁵个·ml^-1的细胞悬液，每皿2 ml，于接种细胞同时加入［³H］TdR,每皿1.85×10⁵ Bq，于37℃，5% CO₂温箱中培养24 h后，加不同剂量GHM-10(4和25 μg·ml^-1)，对照组加入等体积溶剂，作用5 h后，将细胞转移到滤膜（Φ 0.2 μm）上，用冷磷酸缓冲液（PBS）洗3次，加10 ml细胞溶解液，其组成为十二烷基磺酸钠（SDS，华美生物工程公司产品） 0.2%，EDTA 0.02 mol·L^-1，作用3 min，待细胞溶解液自然流出后，加入冷磷酸缓冲液(PBS) 20 ml进一步洗涤细胞，再加碱洗脱液（EDTA 0.02 mol·L^-1，用NaOH调至pH 12）作用5 min，使DNA在碱性条件下变性，控制流速，分步收集洗脱液，每50 min一次，每份约1.5 ml，洗脱过程避光，洗脱完毕，取下滤膜，分别在装有洗脱液和滤膜的闪烁瓶中加入闪烁液（甲苯240 ml，无水乙醇110 ml, triton-X-100 130 ml, PPO 1 g, POPOP 0.025 g），测定cpm，计算膜上DNA残留率（R%），以膜上残留率对时间作图，即得洗脱曲线。

膜上DNA残留率（R%）=M/M+E×100%

M： 膜上DNA每分钟脉冲数(cpm)； E： 分部收集的洗脱液中每分钟脉冲数(cpm)之和

GHM-10对DNA拓扑异构酶II活性的影响收集药物作用12 h的L1210细胞及对照组细胞，用冷PBS洗涤2次，按文献方法^［8］提取并测定酶的活性，观察GHM-10在L1210细胞内对酶活性的影响，并利用对照组的酶，观察GHM-10在细胞外对酶活性的影响。

结果

1单细胞凝胶电泳检测GHM-10对L1210细胞DNA的损伤

通过单细胞凝胶电泳法检测了GHM-10对L1210细胞DNA的损伤。细胞被低融点琼脂糖固定在微型电泳槽上，在碱性条件下细胞溶解，DNA链解旋，经过短暂的电泳后，用EB染色。无DNA损伤的细胞，在荧光显微镜下可见一明亮的荧光圆点，而有DNA损伤的细胞，经电泳后，细胞朝向阳极有一类似彗星的拖尾，拖尾的亮度决定于药物对细胞DNA损伤的程度。如图1所示，细胞经GHM-10 4和10 μg·ml^-1作用4.5 h后，可见明显的彗星状拖尾，随着剂量的加大，彗星拖尾的亮度也增加。而对照组细胞则为一明亮的圆点，说明GHM-10能够损伤L1210细胞的DNA。

Fig 1Comet like tails was formed in L1210 cells treated with different concentrations of GHM-10. Photographs of cells under fluorescence microscope after single cell gel electrophoresis. A. Untreated cells; B. GHM-10 (4 μg·ml^-1) treated cells; C. GHM-10 (10 μg·ml^-1) treated cells.

2GHM-10对L1210细胞DNA拓扑异构酶II活性的影响

DNA拓扑异构酶是一种重要的核酶，能修饰DNA的拓扑结构，引起DNA单链和双链的断裂或再连接。我们采用对超螺旋pUC18 DNA的解旋能力来测定DNA拓扑异构酶II的活性。结果表明，与对照组相比，经GHM-10 4 μg·ml^-1作用12 h的L1210细胞的DNA拓扑异构酶II活性降低（图2）。以对照组L1210细胞的DNA拓扑异构酶II活性为参照，我们测定了GHM-10在细胞外对酶活性的直接影响,结果如图3所示，浓度为(100～500) μg·ml^-1的GHM-10可直接抑制DNA拓扑异构酶II的活性。

Fig 2DNA topoisomerase II activity in nuclear extracts from untreated or GHM-10 treated L1210 cells. The enzyme activity was determined by uncoiling pUC18 DNA, which was located in the bottom zones of the photogra