摘要卡介苗素具有平喘作用，主要含多糖和核酸两种组分，为明确其有效成分，将卡介苗素经核酸酶酶解，去除其中的核酸组成后，经Sephadex g-100柱层析分离纯化，得到一种白色粉末状多糖——卡介菌多糖（BCG-PSA）。该多糖经聚丙烯酰胺凝胶电泳，Sephadex g-200柱层析证实为均一成分。对BCG-PSA的化学组成分析表明，该多糖的分子量为1.705×10⁵，不含硫酸基和糖醛酸。经纸层析、薄层层析及气相层析确证，其单糖组成仅为D-葡萄糖，属均一多糖类。对BCG-PSA的药理研究表明，该多糖具有明显的免疫调节功能和平喘作用，且毒性很小，是卡介苗素抗哮喘的有效成分。

Isolation and Purification of antiasthma Composition

from BCG-PSN and Study on Its Pharmacological Properties

liu Yu, Sheng Hailin¹, Wu Wutong, Wu Wenjun(Biopharmaceutics College, China Pharmaceutical University , Nanjing 210009 ；¹Department of mathematics, China Pharmaceutical University , Nanji ng 210009)

Abstract The purification of BCG-polysaccharide-nucleic aci d (BCG-PSN) was described in this paper. Nucleic acid and protein composition was removed with nuclease an d trichloroacetic acid-butanol respectively. A white powder was got by Sephadex G -100 column chromatography. this white powder was BCG-polysaccharide (BCG-PS A). Examined with polyacrylamide gelelectrophoresis and Sephadex G-200 column chroma tography, the bCG-PSA was homogeneous. The analysis in BCG-PSA's chemical com position showed that its molecular weight was 1.705×10⁵. Its monosaccharide compos ition was D-glucose only confirmed by paper chromatography, TLC and gas chromat ography.

Key WordsBCG-PSN, BCG-PSA, Separation, Pharmacological activity

卡介苗素即卡介菌多糖核酸（BCG-PSN），是由卡介菌中分离提取得到的一种生物活性物质，主要含多糖和核酸两种组分，其中多糖占75%以上。作为一种免疫调节剂其注射剂早在1985年已被列入《生物制品试行规程》，但其进一步的纯化研究工作国内外尚未报道。

多糖类药物如研究较多的香菇多糖^［1，2］，褚苓多糖^［3］，银耳多糖等在免疫调节，抗凝，降血脂，抗肿瘤，抗辐射等方面都具有显著的药理活性，而对一些细菌多糖的研究还较少。卡介苗素是一种免疫调节物质，能提高T细胞的免疫功能并通过激活T细胞，促进白细胞介素（IL-1,2）等的生成以及产生多种免疫调节的淋巴因子，并能增强巨噬细胞的功能，提高机体免疫细胞杀伤细菌、病毒等病原体的能力及提高溶菌酶活力，发挥重要的抗感染作用，在临床上用于防治感冒、哮喘、慢支等，有效率达96.49%。本文研究了卡介苗素的分离纯化及其多糖组分的药理活性，旨在从卡介苗素中分离出一种均一的抗哮喘有效成分。

1仪器与试剂

1．1试剂

卡介苗素（BCG-PSA）由长沙九芝堂提供(商品名“斯奇康”)；核糖核酸酶为中国科学院上海生物化学研究所产品；脱氧核糖核酸酶为包头市生物化学制药厂产品；SephadexG-100,SephadexG-200为进口分装；基础液，氧化液，还原液，阿利新蓝染色液：（以上四种溶液按文献^［5］配制）；蓝色葡聚糖，标准分子量的Dextran为进口分装；

1．2仪器

恒温水浴；721分光光度计；BS423型稳流稳压电泳仪；循环水泵；日本岛津（Shimadzu）GC-9A气相层析仪，记录仪为岛津（Shimadzu）C-R3A。

1．3动物

昆明种小鼠、豚鼠由中国药科大学动物房提供

2实验方法

2．1卡介菌多糖半纯品的提取分离

取卡介苗素1g，以蒸馏水溶解定容至200ml，加Dnase、Rnase各5mg，于35.5℃保温20h，加入氯仿和正丁醇，振摇10min去蛋白，流水透析48h，80℃浓缩，加入预冷的95%乙醇，搅拌均匀，置4℃冰箱过夜，真空干燥得淡黄色粉末0.765g，即为半纯品。

2．2卡介菌多糖的纯化

SephadexG-100层析柱（1.5×40cm）预先用0.02mol/LNaCl溶液平衡。取上述半纯品50mg，溶于2ml0.02mol/LNaCl溶液中，离心除去不溶物，上柱，用0.02mol/LNaCl溶液洗脱，分部收集，每管收集5ml，流速0.5ml/min。用蒽酮试剂比色法测定各管多糖含量^［4］，一直洗到多糖呈阴性反应。合并含糖部分，透析除盐，浓缩，乙醇沉淀，经无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤，真空干燥得卡介菌多糖组分（BCG-PSA）。

2．3卡介菌多糖的纯度检查

2．3．1凝胶柱层析SephadexG-200层析柱（1.5×40cm），预先以0.02mol/LNaCl溶液平衡。取经SephadexG-100纯化所得多糖样品40mg，溶于1ml0.02mol/LNaCl溶液中，离心取上清，如前法收集多糖组分，绘制洗脱曲线。

2．3．2聚丙烯酰胺凝胶电泳胶浓为6%，缓冲液为0.025MpH9.0的硼砂液。样品为2mg/ml，每管进样20ul，电压110伏，每管电流量约2mA，电泳4小时，按文献^［5］方法以阿利新蓝染色。

2．4卡介菌多糖的Mr测定

SephadexG-200层析柱（1.5×40cm），预先用0.02mol/LNaCl溶液平衡。取卡介菌多糖样品15mg，溶于1ml0.02mol/LNaCl溶液中，加入柱顶，用0.02mol/LNaCl溶液洗脱，流速0.5ml/min，按1ml/管分部收集，以蒽酮法测各管含糖量，以测定样品的洗脱高峰体积。同时用五种已知Mr的Dextran标准品（Mr分别为10，000、40，000、70，000、100，000、500，000），用兰色葡聚糖（Mr=2，000，000）测外水体积。

2．5卡介菌多糖的基团分析

2．5．1硫酸基的鉴定^［6］取卡介菌多糖5mg，溶于1ml6mol/LHCl中，封管水解12h，滴加氯化钡试剂，观察有无沉淀产生。

2．5．2糖醛酸分析取卡介菌多糖溶液1ml（5mg/ml），按Bitter［7］的方法测定糖醛酸含量。

2．6组成单糖的鉴定

2．6．1纸层析用慢速层析滤纸15×12cm²，层析点间距2.0cm，与相应的标准单糖样品作对照（D-葡萄糖、D-木糖、鼠李糖、L-阿拉伯糖、盐酸氨基葡萄糖），用乙酸乙酯-甲醇-乙酸-水（12∶3∶3∶2）为展开剂，室温展开15cm左右，晾干后用苯胺-邻苯二甲酸显色^［8］。

2．6．2薄层层析以硅胶GF254按常规方法铺板（15×20cm²），105℃活化30min备用，层析点间距为1.5cm，同样以上述各标准单糖样品作对照，展开剂、显色剂同纸层析。

2．6．3气相层析按文献^［9］方法，将多糖水解物和标准单糖制成还原乙酰化衍生物，进行气相层析。填充柱为5%OV-225/AW-DMCS-ChromosorbW80-100目，1.0×0.3mmid,柱温210℃，载气N₂40ml/min，氢火焰检测器，测定各样品的滞留时间。

2．7卡介菌多糖的药理作用研究

2．7．1平喘试验取经测定引喘潜伏期合格^［10］的幼年豚鼠（体重≤200g）24只，雌雄各半，随机分成4组，连续口服给药10d，于d10给药后1h，按文献^［10］方法测豚鼠的引喘潜伏期，用t值法对结果进行统计学处理。

2．7．2溶血素测定取18～22g小鼠40只，雌雄各半，随机分成4组，按文献^［11］的方法测定半数溶血值HC₅₀。

2．7．3二硝基氟苯诱导小鼠迟发型变态反应（DTH）取18～22g小鼠40只，雌雄各半，随机分成4组，按文献^［12］的方法致敏、攻击，测鼠耳肿胀度、脾指数和胸腺指数，观察各组差异。

3实验结果

3.1卡介菌多糖的纯化

SephadexG-100柱层析洗脱曲线见图1。将卡介菌多糖组分经紫外扫描（400～200nm），260nm、280nm处均无特征吸收，表明核酸、蛋白组分已基本去除，结果见图2。

(1)BCG-ΡSA(2)Nucleic acid component

fig 1Separation of BCA-PSA on Sephadex G-100 column

Fig 2Separation of BCA-PSA on Sephadex G-200 column

3.2卡介菌多糖的纯度检查

3.2.1凝胶柱层析Sephadex G-200柱层析洗脱结果见图2，为一左右对称的<