摘要通过分析丙肝病毒（HCV）的非结构4区（NS₄）和5区（NS₅）蛋白的氨基酸序列，推测确定抗原决定簇位点。用RT-PCR技术从中国丙肝病人血清中扩增克隆含抗原决定簇基因的NS₄及NS₅基因，将该两段基因分别克隆至质粒表达载体pET28a(+)内，转化大肠杆菌BL21（DE3），构建成功了高效表达NS₄和NS₅蛋白的工程菌，IPTG诱导后两蛋白在工程菌内的表达量分别约占菌体蛋白的33%和28%。经Sepharcryl S-200分子筛及Ni-NTA Sepharose螯合层析纯化，获得了较纯的重组NS₄和NS₅蛋白。用纯化的NS₄和NS₅蛋白作抗原ELISA法检测HCV抗体阴、阳性血清，证实它们有较好的抗原性和特异性。

Expression of HCV NS₄ and NS₅ Gene Fragments and

Identification of the Expressed Proteins

Li Yuexi， Zhou Zongan， Tao Kaihua， et al

(East-China Institute for Medical Biotechniques, Nanjing 210002)

AbstractThe NS₄ and NS₅ gene fragments of hepatitis C virus were cloned from anti-HCV positive sera by RT-PCR, the recombinant plasmids expressing NS₄ or NS₅protein were constructed by inserting the cloned NS₄ or NS₅ gene fragme nts into plasmid vector pET28a(+), the expressed NS₄ protein is about 33% of total host (E.coli BL21) proteins, and the NS₅ is about 28%. After purification, the expressed NS₄ and NS₅ protein were used to detect 87 anti-HCV (anti-HCV core and or NS₃ antigen) positive sera and 160 a nti-HCV(anti-core and NS₃ antigens) negative sera, of the 87 positive sera, 28(31%) sera are anti-NS₄ positive and 62(70%) sera are anti-NS₅positive; of the 160 negative sera, 2 sera are anti-NS₄ weak positive and 1 serum is anti-NS₅ weak positive. The results suggest that the NS₄ and NS₅ prot eins have excellent antigenicity and specificity, and may increase the detection rate of anti-HCV when being added in ELISA kit for detection of anti-HCV.

Key WordsHepatitis C virus, Non-structural protein, Gene expression, Protein purification

丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus, 简写HCV）在我国人群中的感染率约为2%，其主要传播途径是经血传播。由于目前无治疗HCV感染的特效药物，所以对HCV的感染者进行早期检测，防止其经血或其它途径传播HCV，是目前阻断HCV传播、降低HCV感染率的主要途径。

目前检测HCV感染的主要方法是检测血清中的HCV抗体。而检测HCV抗体需要优质HCV抗原。从1989年Choo^⑴首次证实HCV为一种单股正链RNA病毒至今，检测HCV抗体的ELISA试剂已经历了三代，这三代试剂的主要差别是使用的抗原逐代增加，1990年Chiron公司研制成功的第一代HCV抗体检测试剂仅用了一个HCV抗原片段（融合有人SOD的部分NS₄抗原），第二代试剂(1992年)以重组HCV核心抗原和非结构3区(NS₃)抗原为主，第三代试剂（1995年）则使用了四种重组抗原（核心抗原，NS₃、NS₄及NS₅抗原），因此试剂的敏感性和特异性逐步提高。

从1990年开始，我们开始对HCV的分子生物学及检测技术进行系列研究，先后克隆表达了重组HCV核心抗原^⑵和NS₃抗原^⑶，并用之研制成功第二代HCV抗体检测试剂（1993年）。为了研制第三代HCV抗体检测试剂，1995年，我们开始筛选克隆表达HCVNS₄及NS₅抗原，并进行了纯化应用。

1材料与方法

1.1菌种与质粒

表达载体pET28a(+)和宿主菌BL21(DE3)由本实验室保存。

1.2分子生物学试剂

各种限制性内切酶、T₄DNA连接酶为美国Biolabs公司或Promega公司产品。DeepVentTaqDNA聚合酶为Biolabs公司产品。dNTP、IPTG、琼脂糖及逆转录酶（AMV）为Promega公司产品。质粒纯化试剂盒、DNA电泳产物纯化试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、及Ni-NTASepharose凝胶为德国QIAGEN公司产品。SepharcrylS-200凝胶为瑞典Pharmacia公司产品。其余使用的分子生物学试剂均为进口或国产分析纯以上级产品。

1.3酶联反应材料

酶联反应板为丹麦产NuncC-8板，酶标（HRP）鼠抗人IgG单抗由军事医学科学院三所提供，底物TMB为苏州大学产品。

1.4HCV抗体阳性血清

由江苏省卫生防疫站、安徽省高桥血站及南京军区总医院提供。

1.5HCVRNA纯化

按异硫氰酸胍/酚/氯仿法纯化，纯化的HCVRNA溶于DEPC处理过的去离子水中，置-20℃冻存。

1.6RT-PCR引物的设计合成

用于扩增NS₄基因片段的外引物对为:P₁:5^′-GTAGGATTGTCTTGTCCGG-3'（5050～5069bp）,P₂:5'-ATCAGCCGGTTCATCCACTG-3'（5740～5759bp)；内引物对为：P₃:5'-ACAGGGAAGTTCTTTACCAAG-3'(5090～5110bp)，P₄:5'-ACGTGTCGGCGCAGTATTGC-3'(5698～5717bp)。用于扩增NS₅基因片段的外引物对为P₅:5'-TCCACTTCGTGACGGGCATG-3'(6296～6315bp)，P₆:5'-ACTCACGGTAGACCAGGACCC-3'（7207～7227bp）；内引物对为：P₇:5'-CAGTACCTGGTCGGGTCACAG-3'(6458～6478bp)，P₈:5'-GGAGGAGTACGACTCAACGTC-3'(7140～7160bp)。

1.7RT-PCR反应

以提取的HCVRNA为模板，加逆转录酶(AMV)后，先置37℃30min，再置42℃逆转录2h。置95℃10min灭活逆转录酶。扩增NS₄基因时逆转录引物用P₂，扩增NS₅基因时逆转录引物用P₆。分别取少量逆转录产物(5μl)，用于套式PCR扩增NS₄和NS₅基因片段。扩增NS₄基因时，先用外引物对P₁和P₂扩增，取少量PCR产物(2μl)，以此为模板再用内引物对P₃和P₄进行扩增，两次扩增条件相同，均为94℃30s、55℃30s、72℃30s，扩增30个循环，最后一轮72℃延伸14min。PCR扩增NS₅基因片段时，以引物P₆的逆转录产物（5.0μl）为模板，先用P₅和P₆外引物对扩增，取少量PCR产物（2.0μl），再用P₇和P₈内引物对扩增。扩增条件同扩增NS₄基因的条件。

1.8常规分子生物学方法

DNA的酶切、连接、电泳，质粒的纯化、转化；蛋白的SDS-PAGE分析等一般分子克隆方法参照“MolecularCloning”一书^⑷。

1.9表达HCVNS₄和NS₅蛋白的纯化

表达的NS₄和NS₅蛋白均分别先用SepharcrylS-200分子筛纯化，再用Ni-NTASepharose螯合层析纯化（具体纯化条件另文发表）。

1.10纯化NS₄和NS₅抗原的鉴定

将纯化获得的NS₄和NS₅抗原梯度稀释后包被酶联板，封闭后用常规间接ELISA检测HCV抗体阴、阳性血清，检测其抗原性和特异性。

2结果

2.1RT-PCR扩增结果

将NS₄和NS₅基因的PCR扩增产物用2%琼脂糖（内含EB染料）电泳检测，紫外灯下观察，均扩增出了一条特异的DNA片段，大小与预期结果相符合。见图1。

A：1.Amplyfied NS₄ gene fragment by RT-PCR

2.DNA markers

B：1.Amplyfied NS₅ gene fragment by RT-PCR

2.DNA markers

Fig 1Analysis of PCR products in 2% agarose

2.2表达NS₄或NS₅基因片段的重组质粒构建

纯化扩增的NS₄和NS₅基因片段，首先克隆至质粒T载体内，分别用引物对P₃、P₄和引物对P₇