摘要分别用Cu²⁺，降解成多肽的无活性的SOD和完整SOD对ICR小鼠灌胃，发现Cu²⁺不引起血液中红细胞SOD的活性变化，而降解后的无活性的SOD却能使红细胞中SOD活性升高，可见降解后的SOD片段可能诱导了内源SOD的生成，口服完整的SOD也能使其活性升高，通过Western-blotting分析，找到了完整的SOD分子经胃肠道吸收、穿过了红细胞膜，进入了红细胞内的证据。

Studies on Oral Delivery of Exogenous Bovine

Cu·Zn-SOD Absorption by Rat Erythrocytes

He Huajun， Shi Huijuan ， Yuan Qinsheng

(Institute of Biochemistry, East China University of Science

& Technology, Shanghai 200237)

AbstractOral delivery of Cu²⁺,degraded inactivated SOD and native SOD to rats respectively. It is found that only oral administrated of Cu²⁺ can not change the activity of the extract of erythrocyte. However, the degraded and native SOD both increased intracellular erythrocyte SOD activity. By western-blotting analys is, further verified the complete native SOD absorption by rat erythrocyte . The possible mechanism is also discussed.

Key WordsSOD ，Oral delivery ，Absorption ，Western-blotting

自从1969年McCord和Fridovich^［1］首次发表从牛血红细胞中发现超氧化物歧化酶（Superoxidedismutase，SOD，EC1.15.1.1）活力以来，以研究氧代谢、自由基学说的分子生物学方面的一系列富有创造性的工作广泛地开展。由于SOD对维持生物体内的超氧阴离子自由基产生和消除的动态平衡的作用，目前临床应用主要集中在抗辐射、抗肿瘤、抗衰老和自身免疫性疾病上，它的应用范围也正不断扩大^［2］。

SOD作为药用酶，临床应用多为胃肠道外注射。虽然一系列的实验表明了SOD的有效性及持久性^［3，4］，但口服后血红细胞SOD的升高是由于通过降解的多肽诱导内源SOD的生成还是具活性肽段的吸收，或者完整的外源SOD吸收？本文分别用Cu²⁺、降解成多肽的无活性的SOD和完整SOD对ICR小鼠灌胃后研究其在血红细胞中的吸收，并探讨了其可能的机制。

1材料与方法

1．1实验材料

牛血Cu·Zn-SOD(300万U/g),上海宝安生物技术公司；ICR小鼠，中科院上海实验动物中心；丙烯酰铵（Acr），N，N’-亚甲双丙烯酰铵（Bis）等均为电泳纯，购自上海生化所西巴斯生物公司；AP标羊抗小鼠IgG及NBT/BCIP试剂盒，华美生物工程公司；其余为进口或国产分析纯。

1．2实验方法

1．2．1小鼠灌胃及取血样^［5］取22(2gICR小鼠，禁食24h，每只灌胃0.2ml,内含目标物溶于NaHCO₃溶液（1.5g/100ml,pH8.2），而Cu²⁺溶于PBS缓冲液（NaCl8g,KH₂PO₄0.24g,Na₂HPO₄1.44g,

KCl0.2g,1000ml,pH7.4）;对照组灌胃相应的0.2ml缓冲液；每组5只。于灌胃后一定时间眼眶放血，取血0.8ml，肝素抗凝，加预冷的PBS缓冲液，3500r/min，15min；然后PBS缓冲液洗3次，每次1500r/min，5min。取血红细胞0.3ml,加入等量去离子水溶血，然后乙醇、氯仿沉淀，取上清测SOD活力及进行SDS-PAGE。

1．2．2SOD活力测定用改进的邻苯三酚法^［6］。

1．2．3SDS-PAGE按浓缩胶5%，分离胶15%进行，操作见文献^［7］。

1．2．4小鼠抗单亚基SOD血清的制备取一定量SOD，于变性缓冲液中（50mmol/LpH6.8Tris-HCl,2%SDS,100mmol/L二硫苏糖醇，20%甘油），混匀，沸水浴3～5min，4℃对PBS缓冲液透析过夜，得到变性的单亚基SOD。常规免疫小鼠，共4次，用免疫双扩散实验测得其对变性单亚基SOD的效价为1∶32，分装于-20℃，保存备用。

1．2．5变性SOD的制备取单亚基SOD10mg，在人工胃液（50mg胃蛋白酶，pH1.5～2的稀HCl5ml）中降解2～4h，用1mol/LNaOH调pH至7.4终止反应。

1．2．6Western-blotting^［7］SDS-PAGE后，电转移至硝酸纤维素膜，脱脂奶粉封闭液（5%脱脂奶粉，0.02%Tween20,溶于PBS缓冲液）封闭1～2h，一抗用1∶100稀释的小鼠抗血清，PBS洗3×10min，再用TNB缓冲液（50mmol/LTris-HCl,150mmol/LNaCl,pH7.5）洗，二抗用AP标的羊抗小鼠IgG（5%脱脂奶粉，0.02%Tween20,溶于TNB缓冲液）。TNB缓冲液洗3×10min，NBT/BCIP显色至适度。

2结果

2．1Cu²⁺灌胃对血红细胞SOD活性的影响

用含Cu²⁺，0.1～10(mol/L的PBS缓冲液0.2ml对ICR小鼠灌胃，取血红细胞上清测SOD活力，未见其活力的显著变化（数据略）。

2．2降解的SOD对血红细胞SOD活性的影响

降解的SOD经测活证实无SOD活性，而且15%的SDS-PAGE凝胶已显示不出降解SOD片段的大小，可见SOD被降解成小分子的肽段。按每只0.5mg灌胃，以时间对SOD活力变化的百分数作图，结果见图1。从图1可知，降解的无活性SOD可引起细胞内SOD活力升高，至7h达到121.4%。

Fig 1Oral administration of degraded SOD on

the SOD activity of erythrocytes

2．3灌胃完整SOD对血红细胞SOD活性的影响

分别用每只0.5mg，2mg，5mg和50mg的量对小鼠灌胃，测其SOD的活力，了解其对血红细胞的活力影响，以时间对SOD活力变化的百分数作图见图2。

Fig 2Oral administration of native SOD on the activity of erythrocytes

从图2可以看出，口服完整SOD能使血红细胞中的SOD活力升高。且随时间变化渐渐升高，然后达到一高峰，再慢慢恢复到原水平。而且随SOD剂量的不同其达活力最高峰的时间和变化程度略有不同。

2．4SDS-PAGE及Western-blotting分析

图3是血红细胞SOD提取物的SDS-PAGE，可以看到在M_r16000附近有一清晰的条带，为SOD带。Cu·Zn-SOD分子由两条相同亚基组成，牛血SOD的M_r约为32000，在变性条件下两个亚基会分开，所以SDS-PAGE上可见其M_r为16000。从对照来看，其内源SOD带亦存在。因为内源小鼠SOD和外源牛的SOD的M_r相差不多，所以从SDS-PAGE上显示不出差别。

1.Protein marker（M_r）2.Partial degraded SOD

3.Standard SOD sample4-9.Oral delivery 5mg SOD after 1,3,5,7 and 9h,respectively

Fig 3 SDS-PAGE of samples of erythrocytes after oral delivery of SOD

图4为Western-blotting的图谱，图4A为标准品、标准品加入小鼠血红细胞样及小鼠血红细胞样。可见小鼠免疫得到的抗血清与内源的SOD的反应检测不到。而牛血SOD与其发生免疫反应，产生清晰的条带。图4B为灌胃每只50mg血红细胞样的Western-blotting的分析图谱，在5h，7h处可见与标准SOD相符的条带，可见与标准SOD具有相同的免疫原性，证实了完整的外源SOD进入血红细胞。

A:1.standard SOD sample

2.Standard SOD plus control extracts

3.2×dilute to line 24.10×dilute to line 2

5.20×dilute to line 26～7.Control

B:1.Blank2.Standard SOD

3～7.Oral delivery 20mg,1,3,5,7and 9h,r espectively

8.Control9.Protein marker（M_r）

Fig 4 Western-blotting of samples of erythrocytes

3讨论

SOD是生物大分子，M_r为32000，虽然实验表明其免疫原性很低,但有报<