摘要选用E.coli偏爱的密码子，用计算机辅助设计合成了四段寡核苷酸序列，通过二步PCR法构建胰高血糖素基因，总长124bp，并直接克隆在pUC18质粒中。序列分析证实合成与克隆的胰高血糖素基因序列与设计完全相符。将该基因引入质粒pKA，使胰高血糖素连在AnsB的C端，实现融合表达。用ELISA和SPR分别检测表达产物。

Synthesis，Cloning and Fusion expression of Glucagon Gene

ding Min Liu Jingjing, Wang Zhaohui, Chen Zhenglan(Department of Biochemistry,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009)

AbstractComputer programming was applied to the design of optimized Segments for the synthesis of the glucagon gene using preferred codon for expression in E.Coli.Four segments were synthesized.After two PCR procedures,the entire geneconsisting of 124 base pairs was constructed,then cloned into plasmid vector pUC18.The DNA sequence of the cloned Glucagon gene was confirmed identical with the designed DNA sequence by auto-sequencing analysis.

the glucagon gene was inserted into plasmid vector pKA which contains L-AspsⅡ gene,and the fusion gene was expressed under the control of promotor trc.The fusion protein had been proved by enzyme labeled immunosorbent assay(ELISA) and surface plasmon resonance(SPR).

Key wordsGlucagon,Gene Cloning,Gene synthesis,Fusion expression

胰高血糖素(Glucagon)是胰岛α-细胞分泌的多肽激素，主要作用于肝脏，促进肝糖元分解，抑制肝糖元合成，促进葡萄糖异生、分解，间接促进脂肪分解，同时也是氨基酸调节的关键激素^［1，2］。

临床上，胰高血糖素是一种疗效确切的低血糖休克急救药^［3］，也可以提高对胃肠进行X-射线检查的效果^［4］。另外，对治疗某些中毒性心律不齐、深度心肌衰竭及分娩性高血压也有疗效^［5］。Novo-Nordisk公司已上市该药^［6］，我国目前尚不能生产。国外曾有胰高血糖素与INF-γ进行融合表达的报道，每升发酵液可获得12mg重组胰高血糖素^［7］。

本工作利用PCR技术合成Glucagon(1～29)全序列，并克隆至载体pUC18中，筛出正确的阳性转化子，并将目的基因引入质粒pKA使其在trc启动子下与AnsB基因实现融合表达。

1材料

1.1质粒与菌株

pUC18购自华美生物工程公司；pKA为本室构建的含ansB基因的质粒^［7］；E.coli jM105为本实验室保藏菌。

1.2DNA化学合成

此工作于中科院上海植生所Beckman oligo-1000DNA合成仪上完成，序列见图1。

1.3酶与其他试剂

限制酶kpnⅠ、HindⅢ及T₄DNA ligase购自promega公司；Taq酶、dNTP、x-gal、IPTG购自华美公司；Rb a Hu Glucagon购自DAKO；羊抗兔酶标二抗为南京农业大学惠赠；丙烯酰胺、N，N′-甲叉双丙烯酰胺购自Sigma公司；Tryptone及Yeast extract购自Oxiod公司；LB培养基及其他buffer均按《分子克隆》的方法配制。

2方法

2.1基因设计

以天然Glucagon的氨基酸序列为基础对氨基酸序列作以下补充。

在编码框架的5′端和3′端分别设置KpnⅠ-EcoRV,HindⅢ酶切位点，便于合成基因酶切后直接克隆到载体质粒中。在5′端KpnⅠ-EcoRV酶切位点和Glucagon(1～29)基因之间设计一个酸水解序列(Asp-pro)以及随后的二肽酶识别序列(pro-pro)对应的密码子，便于目的肽段的融合表达和加工。

根据模板、引物各自的设计要求用计算机检索以确定基因序列，将目的基因分成大小分别为38、54、50、49个碱基的四个寡核苷酸片段，分别进行化学合成，即序列D₁、D₂、D₃、D₄，见图1。

Fig 1 Designed sequence of the Glucagon gene and its corresponding

d1,D2,D3,D4 sequence

2.2用PCR合成glucagon基因

PCR在GL applied research inc.产GTC-2型扩增仪上进行。第一轮PCRD₁、D₂、D₃浓度比为10∶1∶10，共10个循环；第二轮PCR以第一轮PCR产物为模板，D₁、D₄为引物，共20个循环，过程如图2所示。两轮PCR操作程序均为94℃30″；50℃60″；72℃90″。

Fig 2 Schematic presentation of glucagon gene pCR synthesis

2.3Glucagon基因的克隆

PCR反应产物和pUC18均用kpnI、HindⅢ双酶切后回收，在T₄DNAligase反应体系中14℃连接过夜，转化E.coliJM105感受态细胞，涂布含100μg/mlAmp、40μg/mlx-gal和IPTG的LB平板，37℃培养不超过16h，挑取白色菌落。筛选含重组质粒pUG的阳性转化子，常规操作见《分子克隆》。

2.4目的基因克隆至载体pKA。

KpnⅠ和HindⅢ双酶消化质粒pUG和pKA，并相应的用1.2%和0.6%的Agrose回收pUG的小片段和pKA的大片段，纯化后将以上两片段等摩尔混合，连接后转化感受态E.coliJM105并涂布带Amp抗性的平板。获取若干单克隆后，筛选出含重组载体pKAG₁的阳性转化子，用EcoRV、KpnⅠ双酶消化pKAG₁质粒,同时用ScaⅠ和KpnⅠ双酶消化pKA质粒，并用0.6%Agrose电泳回收大片段和小片段，纯化后将两片段等mol混合，连接后转化JM105，用含Amp的LB平板培养，筛选出含重组质粒pKAG₂的阳性转化子(图3)。

Fig 3 Construction of fusion expression plasmid pKAG₂ for glucagon gene

2.5AnsB-Glucagon基因的融合表达

接种转化了表达质粒pKAG₂的工程菌于40mlLB培养基(氨苄青霉素100μg/ml)37℃，180r/min,培养至A₆₀₀约为0.6时，加入IPTG至终浓度为0.1mmol/L，诱导表达2h。

2.6SDS-PAGE

在含0.1%SDS的Laemmli不连续缓冲系统中进行。

2.7表达产物的酶联免疫吸附实验^［8］：

所用抗体为RbaHuGlucagon，二抗以辣根过氧化物酶为标记物，预处理后的工程菌发酵液直接包被微孔酶标检测板。

2.8Glucagon的SPR检测

利用化学自组装技术，在金膜表面制备胰高组糖素的免疫敏感膜，并用SPR对溶液中不同浓度的胰高血糖素的响应作研究^［9］。

3结果

3.1用PCR合成Glucagon基因

图4为二步PCR扩增的结果，由此可见扩增片段大小分别为99bp和124bp与设计的基因大小相同。

ApGEM-7zf(+)/HaeⅢMarker

b PCR product of the first procedure

c PCR product of the second procedure

fig 4.PCR products of the first and second procedure analyzed on a 12% polyacrylamide gel electrophoresis

3.2克隆质粒分析

3.2.1PCR法pUC18两条普适引物P₁、P₂各100pmol，以纯化的重组质粒pUG作模板在50μl体系中作常规PCR操作，PAGE可见216bp条带(图5)。

1.Fragment digested by kpnⅠ+HindⅢ

2.3. pGEM-7zf(+)/HaeⅢ DNA m arker

4. PCR product using P₁，P₂ as primers

fig 5. Electrophoretic identification of pUG by

pCR and res