摘要极大螺旋藻培养液经浓缩，脱盐，醇沉得胞外粗多糖(EPI)。EPⅠ依次经DE-52和SephadexG-100纯化得纯品多糖(EPⅡ)。经SephadexG-200检测，EPⅡ为均一组分，Mr60000。薄层层析、气相层析、红外光谱分析表明，EPⅡ是由L-岩藻糖，D-甘露糖，D-半乳糖，D-葡萄糖和葡萄糖醛酸组成的酸性杂多糖，糖苷键为β型。免疫调节活性试验表明，EPⅡ有提高小鼠的NK细胞杀伤活力，促进IL-2产生及淋巴细胞和混合淋巴细胞转化功能。

Isolation,Purification and lmmunological Activities of

Extracellular Po lysaccharide EPⅡ from Spirulina Maxima

Wu Jie, Zhang Chengwu¹, Liu Yifeng²

(Department of Microbiology,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009; ¹Department of Biotechnology and Science, Nanjing University of Chemi cal and technology, Nanjing 210009;²Medical College, Nanjing University, Nanjing 210008)

Abstract The raw extracellular polysaccharide(EPⅠ)was isolated from the fermentative solution through concentrating、desalting and precipitating with ethanal separately.EP Ⅰwas further purified by loading on DE-52 and Sephadx G-100 column chromatography,so EPⅡ was obtained.EPⅡ was identified by sephad ex G-200 to be homogenous,with the molecular weight 6.0×10⁴.The ultraviolet spectrum of EPⅡ indicated that nucleic acid and protein are absent.The data of IR revealed that EPⅡ is chiefly linked by β-glycosidic bonds.Chemical compos ition analysis by TLC and GC showed that EPⅡ is composed of L-fucose，D-manno se，D-galatose，D-glucose and glucoronic acid.Immunological activity assays in dicated that EPⅡ could improve IL-2 production，killing activity of NK cells ，lymphocyte transformation and mixed lymphocyte response transformation in mice .

Key Words Spirulina maxima，Extracellular polysaccharide，Physicochemical properties，Immunological adjustment

螺旋藻(Spirulina)是一种无分支、螺旋型的丝状蓝藻，蓝藻胞外多糖对其能在生态环境中生存起着重要的作用^［1］。小谷野等^［2］研究发现，盐泽螺旋藻(Spirulina subsalsa)胞外多糖对肉瘤S180，肿瘤细胞株IMC具有明显抑制作用，同时具有免疫增强作用。我们也发现，极大螺旋藻(Spirulina maxima)胞外多糖(EPⅡ)对肿瘤细胞K562有显著的抑制作用，本文研究了EPⅡ的分离纯化、初步结构鉴定及部分免疫活性。

1材料

1.1极大螺旋藻(Spirulina maxima)

藻种来源于美国Taxas大学藻种保藏中心，选用Zarrouk氏培养液，30±5℃，光强4000Lx，充气培养30d。

1.2试剂

DE-52,Sephadex G-100,Sephadex G-200，标准Mr Dextran，咔唑，植物血凝素(PHA)、四甲基偶氮唑盐(MTT)均为Sigma产品，RPMI-1640培液粉为美国GIBCO产品，K562人慢性粒细胞急变白血病细胞购自中科院上海细胞生物学研究所。其余为国产BR.或AR试剂。

1.3仪器

721分光光度计为上海第三分析仪器厂产品；Kontron Uvikon 860型紫外可见扫描仪；Shima dzu GC-9A气相色谱仪；Nicolet-170x FT红外光谱仪；CO₂培养箱；DG3022A酶标免疫检测仪。

1.4动物

BALB/c小鼠：上海实验动物中心

2方法

2.1分离纯化

取30d左右的培养液，绢筛过滤去藻体，浓缩后透析除盐，乙醇沉淀，丙酮脱水干燥得胞外粗多糖(EPⅠ)，EPⅠ经DE-52柱层析纯化，0.1～3.9mol/LNaCl梯度洗脱，苯酚-硫酸法跟踪检测，收集单一峰，经Sephadex G-100柱层析进一步纯化得纯品多糖(EPⅡ)。

2.2纯度鉴定及分子量检测^［3］

Sephadex G-200凝胶柱层析测其纯度，0.1mol/L NaCl洗脱，苯酚-硫酸法检测，作洗脱曲线，并测其洗脱体积Vt，以兰色葡聚糖和标准Mr分别为10400，41000，71400，580000的Dextran相继上柱，得Mr标准曲线，根据样品所测洗脱体积，查标准曲线可得多糖平均分子量。

2.3紫外光谱及红外光谱分析^［4，5］

紫外光谱：190～400cm^-1区间扫描；红外光谱：KBr压片，4000～400cm^-1区间扫描。

2.4单糖组成分析

2.4.1薄层层析以2mol/L H₂SO₄水解浓缩样点硅胶板，展层剂为正丁醇∶乙酸乙酯∶异丙醇∶醋酸∶水=7∶20∶12∶7∶6，苯胺-邻苯二甲酸显色。

2.4.2糖腈乙酸酯衍生物的气相层析据文献方法^［6］将水解样进行干燥，糖腈乙酸酯衍生化后进行气相色谱分析，色谱条件：5% OV-225/chromosorb WPVP 80～100目。

2.4.3糖醛酸含量测定硫酸-咔唑试剂法^［7］，以葡萄糖醛酸为标样。

2.5EPⅡ免疫活性测定^［8］

2.5.1动物分组分组：(1)正常对照组(Normal group)；(2)免疫功能低下组(Weak group)(正常小组2次注射环磷酰胺(cAMP40mg/kg)，先静脉注射，4d后腹腔注射)；(3)免疫功能低下组+EPⅡ(Weak+EPⅡ)(小鼠静脉注射cAMP后，腹腔注射EPⅡ,50mg/kg,共5d，d6进行检测)。

2.5.2淋巴细胞转化实验取小鼠脾细胞(4×10⁷个/ml),加RPMⅠ-1640完全培养液至3ml，再加入PHA100μg，置培养瓶中，于37℃5%CO₂培养箱培养48h，将细胞液混匀，吸取细胞悬液100μl加到96孔板中，加入MTT继续培养4h，于570nm处测定A值。

2.5.3混合淋巴细胞转化实验取BALB/c鼠脾细胞(5×10⁶个/ml)和NIH鼠脾细胞(5×10⁶个/ml)各100μl，加PHA后于同样条件培养16～18h，悬液移入96孔培养板中，加入MTT继续培养4h，于570nm测A值。

2.5.4IL-2活性检测取转化的小鼠脾细胞培养液上清100μl，加入96孔培养板中，再加CTLL细胞100μl(1×10⁵个/ml)同样条件培养48h，加入MTT继续培养4h，于570nm测A值。

2.5.5NK细胞杀伤活力的检测取小鼠脾细胞(2.5×10⁷个/ml)与K562细胞(5×10⁵个／ml)各100μl混匀，1000r/min离心5min，吸去悬液，细胞置96孔培养板中培养2h，加冰的RPMI-164050μl/孔，终止反应，于570nm处测A值。同时设自然释放管(100μlK562细胞，5×10⁵个/ml)，按下式计算NK细胞杀伤活力。

3结果

3.1纯度及分子量检测

DE-52与Sephadex G-100柱层析所得为纯品多糖，冷冻干燥所得的EPⅡ为白色絮状粉末，溶于水呈粘稠状，不溶于乙醇、丙酮等有机溶剂，Sephadex G-200柱层析洗脱峰为单一对称峰(见图1)，表明EPⅡ为均一组分，Mr为60000(见图2)

Fig 1 Gel Chromatography of EPⅠ on Sephadex G-200

Fig 2 Determination of molecular weight of EPⅡ by Sephadex G-200

3.2紫外光谱和红外光谱

EPⅡ的紫外吸收光谱图无260nm和280nm吸收峰，表明不含核酸和蛋白质，红外光谱中两组宽峰3387、2954cm^-1为多糖特征吸收峰(见Fig.3)另外还存在899cm^-1吸收峰，表明EPⅡ分子结构中存在β型糖苷键。

Fig 3 The infrared spectrum of EPⅡ

3.3单糖组成

EPⅡ完全酸水解产物经薄层分析显示，EPⅡ单糖组成中存在L-岩藻糖，D-甘露糖，D-半乳糖，葡萄糖醛酸，为进一步证实薄层层析结果，将EPⅡ水解产物糖腈乙酸酯衍生化后经气相层析分析，结果多了葡萄糖的存在，另外葡萄糖醛酸未出峰，这主要是由于葡萄糖醛酸衍生化后极性仍较大，不易气化；而葡萄糖由于含量较少，薄层层析灵敏度不高，因而未检测出，以肌醇六乙酰酯为内标，根据各个单糖的峰面积计算其摩尔比，并<