摘要目的：建立阿替洛尔两对映体在鼠肝微粒体中的RP-HPLC测定方法。方法：从鼠肝微粒体中提取阿替洛尔消旋体，采用手性衍生化试剂2，3，4，6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖异硫氰酸酯(GITC)对阿替洛尔消旋体进行柱前手性衍生化再以RP-HPLC拆分，测定鼠肝微粒体中阿替洛尔各对映体含量。结果：建立了在碱性条件下从水相中用乙酸乙酯提取阿替洛尔，用GITC进行柱前手性衍生化，以及用流动相NaH₂PO₄缓冲液-CH₃OH-CH₃CN(50∶20∶30）在ODS柱上拆分的分析方法，254 nm波长处检测。阿替洛尔对映体在1～20 μg·mL^-1范围内呈良好线性关系，S(-)-阿替洛尔：Y=840076.5X+141 742.8，r=0.999 8；R(+)-阿替洛尔：Y=873 157.2X+192 187.5，r=0.999 8)，LOD为55 ng·mL^-1，LOQ为145 ng·mL^-1（RSD＜7%），相对回收率在95％～105%（RSD＜5%）。用此方法试验了阿替洛尔在鼠肝微粒体中的代谢测定。结论：结果表明此方法可用于研究阿替洛尔消旋体在鼠肝微粒体中代谢和酶动力学研究。

Resolution and Determination of Enantiomers of Atenolol

in Rats Hepatic Microsome by RP-HPLC

Li XinLiu WeihuaZeng Su

（College of Pharmacy，Dept.of Pharm.Analysis,Zhejiang University，Hangzhou310031）

AbstractObjective：To establish a RP-HPLC method to determine enantiomers of atenolol in rats hepatic microsome.Methods:Extract racemic atenolol from rat hepatic microsome and react with a chiral derivative reagent 2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl isothiocynate (GITC) to form diastereomeric compounds which are separated with a ODS column.Results:A procedure was set up that atenolol was extracted with ethyl estate from rat hepatic microsome and pre-column derivatized with GITC, the diastereomeric compounds were separated in ODS column with the mobile phase of sodium dihydrogen phosphate buffer-methanol-acetonitrile (50∶20∶30), the detection wavelength was 254 nm. The linear range was 1～20 μg·mL^-1 (A-atenolol: Y= 840076.5X+141 742.8，r=0.9998；B-atenolol：Y=873 157.2X +192187.5，r=0.999 8 ). LOD tested was 110 ng·mL^-1 and LOQ was 290 ng·mL^-1（RSD＜7%）. The relative recovery at different concentration were ranged from 94% to 105%。The method was practiced to observe the concentration variance of atenolol enantiomers in rat hepatic microsome after different incubation times.Conclusion:A practical determination method of atenolol enantiomers in rat hepatic microsome by pre-column chiral derivatization RP-HPLC was established. The procedure can be employed to study the enzymatic behavior of atenolol.

Key words atenolol， GITC， rat hepatic microsome， HPLC， chiral derivatization▲

阿替洛尔（atenolol，（+）-4-［2-hydroxy-3-［（1-methylethyl）-amino］ propoxy］ benzeneacetamide，图1-A）作为一种β-受体阻断药，能与去甲肾上腺素能神经递质或肾上腺素受体激动剂竞争β-受体，从而拮抗其β型拟肾上腺素作用，临床上常用于治疗心绞痛和高血压，通常以消旋体给药，但阿替洛尔S（-）-对映体的β-受体阻断作用比R（+）-对映体强^［1］。所以R（+），S（-）-阿替洛尔的手性拆分在药效学和药动学的研究中都具有重要意义。关于阿替洛尔的测定，文献报道多为阿替洛尔消旋体的测定方法，如薄层色谱法^［2］、气相色谱法^［3］以及用紫外和荧光检测器的HPLC法^［4～7］。在手性衍生化法拆分方面Chin SK、Rosseel MT等建立了以S-（-）-β-甲苄基异氰酸酯、(+)-1-(9-芴基)乙基氯甲酸酯为手性衍生化试剂的RP-HPLC法^［8～10］，测定阿替洛尔在血和尿中的对映体含量。

图1结构式

A.阿替洛尔B.GITC

为研究手性药物的代谢机制，需要运用手性分离手段^{［11～13］}。本文应用2,3,4,6-四-O-乙酰基-β-D-吡喃葡萄糖异硫氰酸酯(2,3,4,6-tetra-O-acetyl-β-D-glucopyranosyl isothiocynate，GITC，图1-B)为手性衍生化试剂与阿替洛尔消旋体反应生成非对映衍生物，用RP-HPLC法实现了分离，并建立了阿替洛尔消旋体在鼠肝微粒体中的对映体测定方法。用此方法观察了阿替洛尔在鼠肝微粒体中的代谢情况。

1仪器与试剂

日本Shimadzu LC-10ATvp泵、SPD10Avp紫外检测器。

还原型辅酶Ⅱ(NADPH)、GITC、6-磷酸葡萄糖(G-6-P)、6-磷酸葡萄糖脱氢酶(G-6-PDH)均购自美国Sigma公司，阿替洛尔购自中国药品生物制品检定所。

实验中所用试剂均为分析纯试剂。

NaH₂PO₄缓冲液：精密称取NaH₂PO₄·2 H₂O 0.780 1 g，精确加入水500.0 mL，混匀后用5 μm孔径的滤膜过滤，即得（10 mmol·L^-1，pH=4.64）。

2手性衍生化方法

在0.5 mL含阿替洛尔的微粒体孵育液(由“9”项获得)中，加氯化钠0.2 g及浓氨水50 μL，旋涡振荡30 s，加乙酸乙酯3.00 mL，再旋涡振荡2 min，3 000 r·min^-1 5 min，精密移取有机层2.80 mL至另一试管，加无水硫酸钠约70 mg脱水后，再精密移取有机层2.60 mL至另一试管中，在室温下用空气吹干，加入与药物摩尔比约为1∶2量的GITC乙腈液(称取GITC 2.0 mg，用1.0 mL乙腈溶解，实验中根据需要用乙腈进一步稀释后使用。)，35 ℃恒温反应30 min，吹干后用NaH₂PO₄缓冲液-CH₃CN混合液（50∶30）300μL溶解后，色谱进样20 μL。

3色谱条件

色谱柱：Shim-pack CLC-ODS(25 cm×4.6 mm, 10 μm)；保护柱：ODS(10 mm×5 mm，10 μm）；检测波长：254 nm；灵敏度：0.005AUFS；流速:0.5 mL·min^-1；流动相：NaH₂PO₄缓冲液-CH₃OH-CH₃CN(50∶20∶30)。

此条件下阿替洛尔的微粒体孵育液经手性衍生化后的典型色谱图见图2。

图2阿替洛尔的微粒体孵育液经手性衍生化后的典型色谱图

A.空白鼠肝微粒体孵育液B.加样鼠肝微粒体孵育液

1.S(-)-阿替洛尔(13.64 min)

2.R(+)-阿替洛尔(16.35 min)

4鼠肝微粒体的制备

大鼠（Sprague-Dawley雄性大鼠，体重160～230 g，浙江医科大学实验动物中心提供）用地塞米松磷酸钠(Dex)诱导处理（Dex溶于生理盐水，po 100 mg·kg^-1，3 d；末次给药后，于处死前16 h断食，仅给水），然后断头处死，按文献方法^［14］制备大鼠肝微粒体备用，置-20℃冰冻保存。按Lowry^［15］法测定所制得的鼠肝微粒体中的蛋白质浓度。

5色谱条件的选择

5.1检测波长的选择阿替洛尔衍生物峰在228 nm、254 nm吸收值接近，而在280 nm时吸收值很小。在228 nm时有溶剂峰的干扰，而波长增加则杂质吸收减少，基线易走平。故选择波长为254 nm。

5.2流动相的选择用甲醇、乙腈、水、2%冰醋酸与NaH₂PO₄缓冲液(10 mmol·L^-1，pH 4.64)分别组成流动相进行试验，结果表明，用水和2%冰醋酸与甲醇配制流动相，分离度较好但峰形较差；流动相改用NaH₂PO₄缓冲液可改善峰形。在缓冲液中加甲醇作流动相时峰形较好，但一降解产物峰与R(+)-阿替洛尔峰重叠，加乙腈时该降解产物峰与R(+)-阿替洛尔峰已分开但对映体间分离度较差。根据以上结果我们采用混合溶剂（NaH₂PO₄缓冲液-CH₃OH-CH₃CN(50∶20∶30）作为流动相（图3），得到较好的分离度（R=1.56）和峰形。