沈阳药科大学学报 2000年第4期第17卷 中药研究

作者：杨立宏金向群张薇

单位：杨立宏 张薇（深圳市南山医药公司，深圳518051）；金向群（吉林省中医中药研究院，长春130021）

关键词：中华大蟾蜍；蟾蜍毒素；蟾蜍噻咛；光色素；化学位移

摘要从中华大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans Cantor)皮水溶性部分应用制备型反相HPLC分离得到5个化合物，根据光谱分析、氨基酸分析及化学性质，确定为蟾蜍灵3-丁二酰精氨酸酯(Ⅰ)、华蟾毒精3-丁二酰精氨酸酯(Ⅱ)、脂蟾毒配基3-丁二酰精氨酸酯(Ⅲ)、蟾蜍噻咛(Ⅳ)、光色素(Ⅴ)；其中Ⅳ、Ⅴ为首次从该属动物中得到；并提出了蟾蜍毒素和蟾毒配基在¹³C-NMR谱中C-16位取代情况的化学位移特征.

分类号R284.2

Studies on the Chemical Constituents from the Skin of Bufo bufo gargarizans Cantor

yang Lihong,Jin Xiangqun,Zhang Wei（ shenzhen Nanshan Medicine Company,Shenzhen 518051）

abstract five compounds were isolated from the aqueous extract of the skin of Bufo bufo gargarizans Cantor by means of preparative reversed phase HPLC. On the basis of their spectral data(UV,IR,¹H-NMR,¹³C-NMR,EI-MS and FD-MS),amino acid analyses and chemical properties, they were identified as bufalin 3-succinoylarginine ester(Ⅰ),cinobufagin 3-succinoylarginine ester(Ⅱ), resibufogenin 3-succinoylarginine ester(Ⅲ),bufothionine(Ⅳ),lumichrome(Ⅴ).It is for the first time that compoundsⅣ andⅤ were isolated from B. b. gargarizans Cantor.

Key wordsBufo bufo gargarizans Cantor;bufotoxins;bufothionine;lumichrome;chemical shifts

作者对中华大蟾蜍皮的化学成分进行了研究，从水溶性部分得到并鉴定了5个化合物，其结构见图1.

Fig.1Chemical constituents from the skin of B.b gargarizans Cantor

1仪器与材料

Yanoco MP-S₃显微熔点测定仪（温度计未校正）；中低压液相色谱仪（YZS-3型-天津科学仪器公司）；中低压液相色谱仪（ALPC-100型-日本应用分光机械株式会社）；HPLC仪（分析用Shimadzu LC-6A、Hitachi 9A型；制备用LC-10型）；Shimadzu UV-260型紫外分光光度计；Perkin-Elmer 599B和983G型红外分光光度计；FX-60Q和Bruker AM-250，AM-500型核磁共振仪；Hitachi 835型氨基酸自动分析仪.

Amberlite XAD-2大孔树脂（Rohm ＆ Hass Co,Philadephia）；柱层析用硅胶H（青岛海洋化工厂）；Sephadex LH-20葡萄糖凝胶（进口分装）.展开剂A为CHCl₃-MeOH-H₂O（体积比80∶20∶2.5）；B为n-BuOH-AcOH-H₂O（体积比4∶1∶5）上层；C为AcOEt-MeOH（体积比3∶1）.

中华大蟾蜍(Bufo bufo gargarizans Cantor)4 454只，冷冻处死，立即剥皮，用工业乙醇浸提.

2提取与分离

蟾皮用工业乙醇30 kg 0～4℃冷浸4次，每次一个月，合并浸出液，回收乙醇，得乙醇粘稠液，先用乙醚-水萃取4次；再用乙酸乙酯-水萃取5次.上述残留水溶液50℃以下减压除去有机溶剂，加蒸馏水100 L稀释，流经Amberlite XAD-2大孔树脂，用蒸馏水20 L，12.06 mol/L甲醇1.5 L，17.32 mol/L甲醇5.0 L，19.18 mol/L甲醇5.0 L，22.28 mol/L甲醇5.0 L洗脱，再经硅胶柱层析，中低压液相层析(正相和反相)，HPLC分离及Sephadex LH-20纯化，得到化合物Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ.

3结构鉴定

化合物Ⅰ：无色无定形粉末（甲醇-乙醚重结晶）；mp 238～240℃；TLC（硅胶G）单一斑点，Rf 0.18，展开剂A，HPLC：单峰，t_R 45.0 min，流动相MeOH-H₂O（体积比10∶7），二级管阵列检测纯度＞95%.Liebermann-Burchard反应阳性；Sakaguchi试验阳性；茚三酮试验阴性；提示为甾类化合物，结构中含精氨酸，其α-氨基不游离，盐酸水解后氨基酸自动分析仪测定含有精氨酸；盐酸水解反应薄层层析示含蟾毒灵和丁二酸.分子式C₃₄H₅₀O₈N₄，FD-MS（m/e）M⁺642.UVλ^MeOH_max297.8 nm（α-吡喃酮环）.IRν^KBr_maxcm^-13 600～3 200(OH，NH)，1 158（OH），2 930，1 350（-CH₃），2 870，1 445(-CH₂-)，1 760～1715（酯及内酯-C=O)，1 600，1 545（酰胺-C=O，α-吡喃酮共轭-C=O).¹H-NMR（DMS O-d₆）δ0.60（3H，s，18-CH₃），0.90（3H，S，19-CH₃），2.42（4H，m，-COCH₂CH₂CO-)，4.95（1H，bs，3α-H），6.26（1H，d，J=9.6 Hz，23H），7.49（1H，S，21-H），7.93（1H，q，J=9.6,1.7 Hz，22-H）.¹³C-NMR（DMSO-d₆）δ16.41（C-18），23.34（C-19），53.30（Arg-CH），69.71（C-3），83.27（C-14），113.92（C-23），122.51（C-20），147.14（C-21），148.94（C-22），157.22（Arg-C=NH)，161.02（C-24），169.43(CONH-)，171.36(COO-)，175.28(-COOH).FD-MS（m/e）644（M⁺2H）；513.EI-MS（m/e）386（bufalin），350（386-2H₂O），162，91，41.IR表明分子中具有酯羰基及共轭双健伸缩振动吸收峰，¹H-NMR及¹³C-NMR证明分子中含α-吡喃酮环以及丁二酰基(-COCH₂CH₂CO-).上述分析表明化合物Ⅰ含有下列结构单元：蟾毒灵；(-COCH₂CH₂CO-)；精氨酸.¹³C-NMR中，C-3向低场位移约δ4，而C-14基本未变，因此，成酯应在C-3位上，茚三酮反应提示精氨酸α-氨基不游离，IR显示有酰胺吸收带，其酰胺应由精氨酸α-氨基提供氨基部分.化合物Ⅰ¹H-NMR、熔点及分子量与蟾毒灵3-丁二酰精氨酸酯^〔1〕一致；¹³C-NMR与蟾毒灵^〔2〕和精氨酸^〔3〕一致.鉴定化合物Ⅰ为蟾毒灵3-丁二酰精氨酸酯.

化合物Ⅱ：无色无定形粉末（甲醇-乙醚重结晶）；mp 200～202℃；TLC（硅胶G）单一斑点，Rf 0.18，展开剂A，HPLC：单峰，t_R 32.5 min，流动相MeOH-H₂O（体积比10∶7），二级管阵列检测纯度＞95%.Liebermann-Burchard反应阳性；Sakaguchi试验阳性；茚三酮试验阴性.盐酸水解经氨基酸自动分析仪测定含精氨酸；盐酸水解反应薄层层析示含华蟾毒精和丁二酸.分子式C₃₆H₅₀O₁₀N₄，FD-MS（m/e）M⁺698.UVλ^MeOH_max294.2 nm（α-吡喃酮环）.IRν^KBr_maxcm^-13 380，1 140（OH），3 200（NH），2 950，1 380(-CH₃)，1 730～1 690（酯，羧酸C=O)，1 640，1 550（酰胺-C=O，α-吡喃酮环共轭-C=O)，1 250（乙酰基C-O).¹H-NMR（CD₃ OD）δ0.82（3H，S，18-CH₃），1.01（3H，S，19-CH₃），1.87（3H，S，16β-OCOCH₃），2.60（4H，m，COCH₂CH₂CO），2.91（1H，d，J=9.3 Hz,17α-H），3.73（1H，S，15α-H），4.27（Arg-CH），5.07（1H，bs，3α-H），5.48（1H，d，J=9.3 Hz,16α-H），6.23（1H，d，J=9.7 Hz,23-H），7.36（1H，S，21-H），8.00（1H，bd，22-H）.¹³C-NMR（CD₃OD）δ17.50（C-18），20.35(-OCOCH₃)，22.12（C-19），40.42（C-9），40.68（C-12），46.37（C-13），51.52（C-17），55.22（Arg-CH），60.61（C-15），72.36（C-3），73.42（C-14），76.62（C-16），114.10（C-23），118.31（C-20），150.76（C-21），153.51（C-22），158.60（Arg-C=NH)，163.92（C-24），171.60(C=O，16 β-OAC），173.46(CONH-)，173.81(COO-)，177.93(-COOH).FD-MS（m/e）699（M⁺+H），655（M-COCH₃）.EI-MS（m/e）442（cinobufagin），399（442-COCH₃），233，215，43（⁺COCH₃）.据IR、UV、¹H-NMR及¹³C-NMR推测该化合物为蟾毒素类化合物. 盐酸水解反应薄层层析示含有华蟾毒精；EI-MS（m/e）有442碎片与华蟾毒精分子量（442）一致；215，233示C₁₄和C₁₅具有三元氧环结构.氨基酸分析及¹³C-NMR证实分子中含精氨酸.FD-MS（m/e）699（M⁺+1）.¹³C-NMR给出了36个碳信号，并证实成酯在C-3位上，IR及茚三酮反应证实分子中所形成的酰胺结构由精氨酸提供α-氨基.¹H-NMR和盐酸水解反应薄层层析证实有-CO(CH₂)₂CO-存在. 化合物Ⅱ¹H-NMR、熔点及分子量与华蟾毒精3-丁二酰精氨酸酯^〔1〕一致. EI-MS与¹³C-NMR分别与文献