摘要对发根农杆菌的性质及其Ri质粒的结构和功能，毛状根的转化方法，毛状根培养物的特点，Ri质粒在植物次生代谢产物中的应用进行了综述.表明了利用毛状根培养是生产植物次生代谢产物的一条新途径.

分类号Q946

The Ri Plasmid of Agrobacterium rhizogenes and Its Application to Plant Secondary Metabolites

Zhang Hui,Yu Rongmin

（Department of Pharmaceutics，Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015）

AbstractThis article is a review about the characters of Agrobacterium rhizogenes,the structure and function of its Ri plasmid,the transferring method of hairy root,the feature of culture material from hairy root and the application of Ri plasmid to plant secondary metabolites.The result shows that utilizing hairy root culture is a new effective method to produce plant secondary metabolites.

Key words Agrobacterium rhizogenes;Ri Plasmid;hairy root；secondary metabolite

1982年Chilton报道发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)能诱导植物产生发状根(hairy root)^〔1〕.这种发状根又称毛状根，毛状根是由发根农杆菌含有的Ri(root inducing)质粒引起的.其后，国内外的学者对发根农杆菌进行了不断的深入研究，特别是在生产植物次生代谢产物方面取得了很大的进展.本文就有关发根农杆菌的特性及致病机理、毛状根在植物次生代谢产物的应用等问题综述如下.

1发根农杆菌

1.1发根农杆菌的特性

发根农杆菌是一种革兰氏阴性土壤细菌，它能够感染大多数双子叶植物和少数单子叶植物及裸子植物，引起寄主植物患毛根病.

根据Ri质粒转化植物后产生的毛状根合成冠瘿碱(opine)的类型不同，将Ri质粒分为3种类型：甘露碱型(mannopine type)、黄瓜碱型(cucumopine type)和农杆碱型(agropine type).发根农杆菌的致根特性与其所带的Ri质粒类型有关，有人对不同类型的发根农杆菌的致根特性进行了比较，发现带有农杆碱型Ri质粒的农杆菌比带有甘露碱型或黄瓜碱型Ri质粒的农杆菌有更广的寄主范围，即使对同一种农杆菌来说，致根特性又与被接种的寄主植物及接种的部位有关^〔2〕.

1.2Ri质粒的结构和功能

Ri质粒具有两个非常主要的功能区即T-DNA(转移区)和Vir(致病区).农杆碱型Ri质粒上的T-DNA是不连续的，分为T_L-DNA和T_R-DNA.T_L-DNA上存在与根的形态有关的基因，同时T_L-DNA也影响再生植株的茎、叶的形态和一些生理性状^〔2〕.T_R-DNA上有生长素合成基因tms 1和tms 2，指导IAA(吲哚乙酸)的合成，因此转化产生的毛状根，在培养时不需要添加外源生长激素，为激素自养型.甘露碱型和黄瓜碱型Ri质粒的T-DNA是连续的，其上T-DNA不含有生长素合成基因，与农杆碱型Ri质粒的T_R-DNA没有明显的同源性，但与T_L-DNA具有高度同源的片段.甘露碱型Ri质粒的致病性较弱，感染时有外源生长激素的存在可以提高毛状根的转化率，产生的毛状根能够在无激素培养基上迅速增殖.

3种类型的Ri质粒上Vir区具有很高的保守性.Vir区基因在转化过程中虽然不发生转移，但是它对T-DNA的转移起着非常重要的作用.在通常状态下Vir区的基因处于抑制状态，当发根农杆菌感染寄主植物时，受损伤的植物细胞合成的特殊的低分子苯酚化合物乙酰丁香酮.这种低分子苯酚类化合物能够刺激农杆菌，使Vir区处于抑制状态的基因被激活^〔4，5〕，产生一系列限制性核酸内切酶，在酶的作用下产生T-DNA链，并引导T-DNA链与细菌细胞膜上的特定部位结合，然后向植物细胞转移，进入植物细胞核内，T-DNA随后整合进植物细胞的基因组.

2毛状根的转化方法

发根农杆菌Ri质粒是基因转移的天然载体，人们利用这种载体对植物进行转化.转化方法如下.

2.1植物体直接接种法^〔6，9〕

将植物种子消毒后，在合适的培养基上进行萌发，长出无菌苗.取茎尖继续培养，等无菌植株生长到一定时候，将植株的茎尖、叶片切去，剩下茎杆和根部，在茎杆上划出伤口，将带Ri质粒的农杆菌接种在伤口处和茎的顶部切口处，接种后继续培养被感染的植株.经过一段时间培养，在接种部位产生毛状根.这种方法是最为简便的，但它仅适合于可以用茎尖继代培养的植物.

2.2外植体接种法^〔7〕

取植物的叶片、茎段、叶柄等无菌外植体，与农杆菌共同培养2～3天，将植物的外植体移到含有抗生素的选择培养基上进行培养，经过不断继代培养，农杆菌被杀死，转化细胞产生愈伤组织，并可诱导产生毛状根.

2.3原生质体共培养法^〔8〕

将愈伤组织按常规方法制备成原生质体，原生质体再生细胞与农杆菌混合，共同培养，农杆菌对原生质体进行转化.经过在含有抗生素的选择培养基上对转化细胞进行筛选，得到转化细胞克隆，最后在分化的培养基上得到完整植株.原生质体共培养法要求原生质体有较高的再生率，对那些原生质体培养还没有成功或再生率很低的植物难于使用这种方法.

3毛状根培养物的特性

由发根农杆菌感染植物，诱导产生的毛状根具有生长迅速、多分枝、多根毛、没有向地性等特点.在黄芪毛状根的悬浮培养中^〔10〕，毛状根最大生长量可达到初始接种量的35倍.由于毛状根生长速度快，所以在生长周期上，一般没有明显的生长迟滞期.毛状根的培养不需要添加外源激素.

一条毛状根起源于一个细胞，具有遗传稳定性.毛状根的这种性质及其特异表型，为转化体的筛选提供了方便.

由毛状根分化产生的再生植株表现为叶皱缩、节间短、叶幅宽、根系异常发达，产生大量的不定根.但也有的再生植株具有完全正常的表型.

4毛状根在植物次生代谢产物研究中的应用

利用植物组织培养和细胞工程的方法生物合成药用植物次生代谢产物的技术随着研究的不断深入，这一生物技术得到日益发展和成熟，同时也引起人们极大兴趣.但是要形成工业化生产也受到了诸多因素的限制.首先是生产周期长，前期投入大.其次是在组织培养的前期，常常得到的愈伤组织不产生目的产物，或目的产物含量与天然植物含量相比，含量极低.培养毛状根的方法与愈伤组织培养和细胞培养的方法相比，在生物合成次生代谢产物上具有很多的优越性.突出表现为毛状根生长迅速，周期短，目的产物含量高并且稳定.此外，尚可从毛状根培养物中寻找新的化合物.因此毛状根的培养是生产次生代谢产物的一条新途径，同时对工业化生产具有更大的潜在应用价值.

目前已有数百种植物感染Ri质粒后产生毛状根^〔11〕.这对于那些来自于根部的次生代谢产物的生产具有非常重要的意义.由毛状根可以生产生物碱(alkaloid)、蒽醌(anthraquinone)、萘醌(naphthoquinone)、多糖类(polysaccharides)、皂苷(saponins)、蛋白(protein)等代谢产物.国内外在这方面的研究已取得了可喜成就.Yoshikawa等^〔12〕 (1987)通过人参愈伤组织诱导出毛状根，在无外源激素的条件下，其生长速度是愈伤组织的2倍，人参皂苷含量最高为干重的0.95%，高于再生根(0.91%)和天然栽培根(0.4%)的含量.虽然人参悬浮细胞培养及再生根培养规模已达到2万升水平^〔13〕，人参皂苷含量也较高，但由于在培养过程中添加激素，因此一直不能作为药品上市.又如长春碱和长春新碱是存在于长春花中的具有抗癌作用的双吲哚生物碱，在长春花细胞培养中，一直未能检测到这两种生物碱.Parr等^〔13〕通过诱导长春花形成毛状根，从毛状根中检测到了长春碱.这说明毛状根能合成某些悬浮培养的细胞不能合成的次生物质.Flores等^〔7〕(1985，1987)报道，他们建立的20多个埃及天仙子毛状根无性系，全部比正常根生长快得多，而且产生的托品生物碱含量达到正常根培养水平.在研究中发现，一旦根被诱导成愈伤组织，则生物合成能力急剧下降，再分化成根后，又恢复原有的生产水平.这表明植物细胞次生代谢物的累集与细胞分化成正相关.

张荫麟等^〔9〕(1988)建立了赛莨菪的发根培养体系，在发根培养物中含有莨菪碱和东莨菪碱，最高含量分别达干重的0.35%和0.10%.费厚满等^〔14〕(1993)对绞股蓝转化毛状根，得到的毛状根在无激素的MS培养基中悬浮培养20天，其生物量增加9倍，远远超过未分化根和多数细胞培养物.毛状根中总皂苷含量约为自然根的2倍.在悬浮培养中，培养物向培养基中分泌一定量的皂苷.邱德有等^〔15〕(1996)利用栝楼毛状根生产天花粉蛋白，其含量可达每克鲜重中含8.16 mg.近年来，发现天花粉蛋白能够抑制绒毛膜上皮癌细胞的生长和调节免疫反映.还发现天花粉蛋白GLQ223能够选择性地抑制爱滋病病毒HIV在感染的免疫系统细胞的复制，降低免疫细胞中受病毒<