摘要综述了氨基糖苷类抗生素的体内分析方法.主要有：生物学分析法；薄层色谱法；高效液相色谱法；差示脉冲极谱及各种免疫法，如酶免疫法，荧光偏振免疫法，胶乳凝集抑制速率比浊法等. 其中高效液相色谱法和免疫法应用较多.

分类号R914.4

Determination of Aminoglycoside Antibiotics in the Biological Fluid

Er Yan，Sun Changshan

（Department of Pharmacy,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015）

AbstractThe determination of aminoglycoside antibiotics in the biological fluid has been reviewed.The methods mainly included bioassay,thin-layer chromatography,high-performance liquid chromatography(HPLC) and a variety of immunoassay(IA),for example,enzyme immunoassay,fluorescence polarization immunoassay,quenching fluorescence immunoassay,chemiluminescent immunoassay，etc.,in which HPLC and IA were used more often.

Key words aminoglycoside antibioties;determination in the biological fluid;gentamicin

氨基糖苷类抗生素是一类应用广泛，需进行治疗药物监测的广谱抗菌药物，主要包括庆大霉素(GM)、链霉素(SM)、卡那霉素(KM)、巴龙霉素(PM)、新霉素(NM)等.此类抗生素的基本结构都是氨基环醇和氨基糖缩合而成的苷，含氨基或其它碱性基团. 它们是浓度依赖性抗生素，即药物的杀菌速度及程度取决于药物浓度，浓度越高，杀菌作用越强，故建立快速、灵敏、准确的分析方法是非常必要的.其体内分析方法国内外报道都较多，尤其是GM.

1体内过程

氨基糖苷类抗生素口服难吸收.如GM，口服吸收只有2%左右，对于全身性感染须注射给药，肌注后，30～90 min达血浓峰值.此类药在体内各部位的分布和消除速率不同，且受年龄和肾功能的影响.GM在血清中结合较少，而与肝、肾、肺等部位结合较多.一般肾功能正常者清除半衰期约2～4 h，而慢性肾障碍者增至40～120 h.它们在体内破坏少，大部分以原形从尿中排出.治疗浓度范围较窄，个体差异大，一般为6～20 μmol/L，超过20～30 μmol/L血清浓度时可引起耳中毒及肾损伤，所以此类药物需进行临床监测，确保用药安全有效.

2分析方法

氨基糖苷类抗生素的临床监测常采用血样，检查肾毒性时常采用尿样. 采用胸膜渗出液和脑脊液测定结果虽比血清灵敏度高，但显然取样不便. 对于新生儿和在需放置时间较长方能测定的情况下则采用滤纸干血斑点，方法简述如下^〔1〕.50 μL 全血或血清滴于定量滤纸,干燥后在含Na₂HPO₄的超滤试管中保温洗脱1 h，洗脱物离心后即得检测样品.国内采用5%三氯醋酸除蛋白也能达到同样效果.纸上干血可室温保存7～8 d，纸上的血清回收率达90%以上.滤纸干血斑点中血红蛋白含量每24 g/L会对所测药物浓度产生2 mg/L的误差，所以除蛋白很重要.

此类抗生素的体内分析方法主要有生物学测定法，薄层色谱法，高效液相色谱法，免疫法和差示脉冲极谱法，下面对此5种方法逐一介绍.

2.1生物学测定法

过去国内临床测定氨基糖苷类药物血浓多用微生物法(MA).

2.1.1单剂量法

又称标准曲线法. 此法应用含菌琼脂培养基辅平皿，在平皿上放若干不锈钢管，钢管中加一定浓度的抗生素，37℃培育14～16 h后，钢管周围产生抑菌圈，其直径与抗生素浓度成正比，所以抗生素标准浓度的对数与其相应抑菌圈直径作图，可得标准曲线.应用此标准曲线，可算出血清中待测抗生素浓度^〔2〕.此方法简单，但费时.

2.1.2比色微生物分析法

应用枯草芽苞杆菌的培养基，百里酚酞为比色显示剂.含抗生素的血样在培养基上培养后，观察其颜色. 若为海军蓝，则表示血药浓度超过了治疗范围，淡蓝色表示在治疗范围内，白色说明浓度很低^〔3〕.此法方便易行，用肉眼即可估计出血药浓度.

2.1.3生物发光系统

从一种真核或原核生物中引出能促进生物发光的外源性基因，将其注入本身不发光或很难发光的宿主微生物体内，通过检测宿主基因表现出的发光度来分析抗生素的生物样品^〔4〕.

微生物法所需设备简单，价格低廉，但影响因素复杂，需考虑操作环境是否适宜，且较耗时，不能满足临床上急危重病人需快速检测血药浓度的要求，所以已逐渐被淘汰.

2.2高效液相色谱法(HPLC)

各种测定此类药物浓度的HPLC的主要区别是所用衍生化试剂不同以及是柱前还是柱后衍生.常用衍生试剂有邻苯二醛(OPA)、茚三酮等.由于氨基糖苷类药物在水中易溶，在非极性有机溶剂中不溶或微溶，因此色谱分离前不能用有机溶剂提取药物.通常是用蛋白质沉淀剂除去蛋白，或将体液通过CM-Sephadex柱或硅胶柱.

2.2.1柱前衍生

李好枝等^〔5〕用柱前衍生HPLC法检测了尿液中GM含量.二氯甲烷除尿中干扰物，用OPA衍生水相中GM，醋酸乙酯提取.提取物经色谱柱分离，荧光检测.回收率96.2%，检测限10 μmol/L，日内变异系数小于5%；张强等^〔6〕在前人基础上用乙腈沉淀血清中干扰物，以茴香胺为内标物，OPA衍生，紫外检测，硫酸庆大霉素出现C₁、C_1a、C₂3个峰；国外有用托普霉素作测定血浆和尿液中GM的内标物，荧光检测，检测限可达0.6 μmol/L^〔7〕.

以上各HPLC均以OPA柱前衍生，衍生物再进入反相色谱柱.各法的样品预处理和检测方法有异.紫外衍生重现性不如荧光衍生，测紫外吸收时，要尽量使衍生物浓度高，如采取改善流动相、pH值及加内标物等手段提高灵敏度.紫外和荧光检测中样品预处理都很重要.

2.2.2柱后衍生

此法将样品在色谱柱上分离后再加衍生试剂，因而对柱的损害比柱前衍生小.柱后衍生的装置比柱前衍生稍复杂，多一个泵以及T形管和反应管，流动相中常加入己烷二磺酸钠、庚烷、辛烷磺酸钠等反离子.

Hiroaki Kubo等^〔8〕用3.5%高氯酸除血清中蛋白质后检测SM含量，流动相中含茚三酮作荧光衍生试剂，碱性条件下柱后衍生化，从样品处理到检测完毕不足15 min，检测限1.7 μmol/L血清，回收率(100.0±0.3)%.类似的，可先将稀释后的生物样品在磁性合金C₁₈柱上分离，采用合适内标物，OPA柱后衍生化.

HPLC由于测定迅速准确,流动相选择范围广,灵敏度高(10^-12 g/mL以上)，所以是实验室研究中一种很好的体内分析方法，在国内外都很受重视.

2.3薄层色谱法(TLC)

TLC虽然操作简便，分析结果直观，但应用范围不广，报道很少.

先将血样酸化，以潮霉素B作强化剂，结合于共聚物键合硅胶柱上，用二乙胺-甲醇洗脱，洗脱液用TLC分析，展开液为丙酮-乙醇-氨水.潮霉素B带于酸性下荧光衍生化，紫外灯下可见.根据Rf值不同可分离各种氨基糖苷类抗生素，新霉素(NM)与GM的检测限为50 ng，这是一种半微量分析法，已应用于分离分析动物体液中抗生素^〔9〕.

2.4免疫分析法(IA)

IA是近年来发展很快的一种体内分析方法.它将分析方法与免疫反应原理结合,进行超微量分析,具有灵敏度高(10^-9～10^-12 g)、特异性强、用样少、适用范围广、操作简便等优点，已有试剂盒广泛应用于临床.反应原理如下：

标记抗原抗体复合物.

药物作为半抗原进行竞争结合.根据对抗原标记方法不同，IA可分为放射免疫法(RIA)、酶免疫法(EIA)、荧光偏振免疫法(FPIA)等.RIA有放射性污染，后处理困难，需同位素示踪室和计数仪器，费用较高，所以目前已很少应用.

2.4.1酶免疫法(EIA)

均相酶免疫法是EIA的一种.SyVa公司的酶放大免疫测定技术(EMIF)可用于测氨基糖苷类的体内浓度，其测定值非常接近靶位浓度，适于临床应用，但重现性不如FPIA.

2.4.2荧光偏振免疫法(FPIA)

抗原用荧光标记，激发光经偏振板后产生的偏振激发光照射到免疫反应装置上可产生偏振荧光. 标记抗原运动散乱，而形成的标记抗原抗体复合物运动有序. 所以偏振荧光的强度与未标记抗原量成比例.应用此原理，美国Abbot公司生产了TDx试剂盒，测试计算全自动化，灵敏度高.

Pyder.D^〔10〕等将血样稀释5倍后用TDx测SM含量，检测限8.6 μmol/L，结果准确.TDx系统重现性很好，连续测定GM，托普霉素等药物含量6年，每月测一次，线性无偏差，且同一标准曲线可连续使用19周.FP