摘要：为建立乌头碱酶免疫测定法，合成了乌头碱衍生物，用羟基琥珀酰亚胺酯的方法制备半抗原(活性酯)，并用其半抗原与BSA(Bovine Serum Albumin)在有机溶媒/磷酸缓冲液(pH7.3)的条件下制备了抗原性BSA结合物.结果显示，这种活性酯的方法可用于乌头碱酶免疫测定法中与BSA或酶交联的有效方法.

分类号：R914.4

The Preparation of Aconitine N-Hydroxysuccinimide Esters and Their Reactivities with Bovine Serum Albumin

Zhao Huaiqing,

（Department of Basic Courses,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang 110015;）

Hattori Masao

（Toyama Medical and Pharmaceutical University,Toyama,930～01,Japan）

Abstract：In order to establish the enzyme immunoassay of aconitine,aconitine derivatives were synthesized,which is called the chemical bridge.The preparation of the hapten of aconitine was carried out by the N-hydroxysuccinimide esters method.These activated esters were covalently linked to BSA(Bovine Serum Albunin)in an organic solvent/phosphate buffer(pH 7.3) employing 1∶30 molar ratio of the aconitine to protein.The results indicated that the activated ester method would be useful for enzyme labeling in enzyme immunoassay of aconitine in respect of simplicity and reproducibility.

Key words：aconitine;hapten;N-hydroxysuccinimide ester;immunogenic conjugate；synthesis▲

乌头碱(aconitine)是附子(aconiti Tuber)中的主要成分，也是毒性很强的成分，但经肠内代谢之后可以转变为无毒的次乌头碱(lipoaconitine)^〔1〕.为建立乌头碱酶免疫测定法，以测定其肠内代谢产物含量，合成了乌头碱的衍生物，并用羟基琥珀酰亚胺酯与BSA交联制备乌头碱的抗原性BSA结合物(immunogenic conjugate).

1合成路线设计

乌头碱8位羟基的醋酸酯易与长链脂肪酸发生置换反应^〔2〕，基于此，合成了2种衍生物.以乌头碱为原料，三甲基吡啶为催化剂，分别与十六碳二酸和琥珀酸反应，得到的衍生物1(AH)和衍生物2(AS)，在DCC(N，N′-Dicyclohexyl-carbodiimide)的存在下，与羟基琥珀酰亚胺缩合，得到了2种羟基琥珀酰亚胺酯(半抗原A(AHHS)和B(ASHS)，也称活性酯).得到的半抗原A和B，分别在pH 7.3的水溶液中与BSA反应，生成抗原性BSA结合物Ⅰ(AHHS-BSA)和Ⅱ(ASHS-BSA).见图1.

Fig.1Synthesis of the derivatives of aconitine and its immungenic conjugate

2实验部分

熔点用Yanagimoto显微熔点测定仪测定，未校正；旋光度用JASCO DIP-360型旋光仪在20℃下测定；IR光谱用JASCO FT/IR-230红外分光光度计测定；核磁共振光谱用Varian Unitityplus 500及Gemini-300型核磁共振仪测定，CDCl₃为溶媒，TMS为内标；AP-MS用Perkin-Elmer SCIEX APIⅢ型质谱仪测定.

2.1衍生物的制备

2.1.1衍生物1(AH)的制备

称取乌头碱(标准品)12.3 mg(0.019 mmol)，溶解于THF(0.5 mL)中，另取Hexadecanedionic Acid 93.1 mg(0.33 mmol)，加入三甲基吡啶(0.5 mL)，将两溶液混合，搅拌下于70℃回流5 h，减压除去溶媒，白色残渣经硅胶柱层析(CHCl₃—MeOH=8∶2)精制，得到无色油状物1(14.2 mg，回收率85.5%).［α］²⁰_D+4.0(C=0.7，CHCl₃).IRν^KBr_maxcm^-1：3482(OH)，1722()，1606，1582，1450(—C₆H₅).¹H-NMR(CDCl₃)δ：1.12(3H，t，J=7.0 N—CH₂—CH₃)，3.17(3H,s,6—OCH₃)，3.28(3H,s，1—OCH₃)，3.30(3H,s,18—OCH₃)，3.77(3H，s，16—OCH₃)，3.33(1H，d，J=6 Hz，C₁₆—H)，4.87(1H,d，J=5.5 Hz，C₁₄—H)，7.44～7.48(2H)，7.56～7.59(1H)，8.02～8.04(2H)(—C₆H₅)，2.35(2H，t，J=7.5 Hz，—COCH₂—CH₂—)，1.65(2H，t,J=7.5 Hz，—CH₂—CH₂—COOH).¹³C-NMR(CDCl₃)δ：175.2(—COOH).API—MS m/z：(positive)872(M+H)⁺，(negative)870(M-H)⁺.

2.1.2衍生物2(AS)的合成

称取乌头碱29.6 mg(0.046mmol)，溶解于THF(1.5mL)中，另取琥珀酸123.5 mg(1.05 mmol)，加入三甲基吡啶(0.12mL)，70℃搅拌下回流20h，减压除去溶媒.残渣用硅胶柱(CHCl₃—MeOH=7∶3)层析精制，得无色油状物2(21.8mg，收率为67.7%).［α］²⁰_D-0.5°(C=0.8，CHCl₃).IRν^KBr_maxcm^-1：3450(OH)，1729()，1660，1582，1455(—C₆H₅).¹H-NMR(CDCl₃)δ：1.11(3H,t,J=7.0 Hz，N—CH₂—H₃)，3.17(3H，s，6—OCH₃)，3.28(3H，s，1—OCH₃)，3.30(3H，s，18—OCH₃)，3.77(3H，s，16—OCH₃)，3.34(1H，d，J=5.5 Hz，C₁₆—H)，4.87(1H，d，J=5.5 Hz，C₁₄—H)，7.44～7.47(2H)，7.56～7.59(1H)，8.02～8.04(2H)(—C₆H₅)，2.61(2H，t，J=7.5 Hz)，—CO—CH₃—CH₂—)，1.75(2H，t，J=7.5 Hz，—CH₂—CH₂—COOH).¹³C-NMR(CDCl₃)δ：175.3(—COOH)，API—MS m/z(positive)704(M+H)⁺，(negative)702(M-H)⁺.

2.2半抗原的制备

2.2.1半抗原A的制备

方法1取衍生物HA 23.5 mg(0.027 mmol)，溶解于CH₂Cl₂(3 mL)中，依次加入N-羟基琥珀酰亚胺5.2 mg(0.05 mmol)和DCC 9.8 mg(0.05 mmol)，在室温下搅拌24 h，过滤，去除沉淀，减压除去滤液中的溶媒，残渣用硅胶柱(CHCl₃—MeOH=19∶1)层析精制，得无色油状的羟基琥珀酰亚胺酯即半抗原A(17.2 mg，收率为65.9%).［α］²⁰_D+2.4(C=1.7，CHCl₃).IRν^KBr_maxcm^-1：3450(—OH)，1780，1720()，1600，1582，1455(—C₆H₅).¹H-NMR(CDCl₃)δ：1.22(3H,t,J=7.0 Hz，N—CH₂—CH₃)，3.22(3H，s，6—OCH₃)，3.28(3H，s，1—OCH₃)，3.29(3H，s，18—OCH₃)，3.76(3H，s，16—OCH₃)，3.34(1H，d，J=5.5 Hz，C₆—H)，4.91(1H，d，J=5.5 Hz)，7.44～7.48(2H)，7.56～7.59(1H)，8.02～8.04(2H)(—C₆H₅)，2.85(4H，s，8—succinimidyl).¹³C-NMR(CDCl₃)δ：173.2(4C,8—succinimidyl).

方法2称取衍生物HA 24.7 mg(0.028 mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺3.91 mg(0.034 mmol)，溶解于二氧六环(2 ml)中，在0℃搅拌下加入EDC［1-Ethyl-3(3-dimethyl-aminopropyl)-carbodimide HCl］6.52 mg(0.034 mmol)，然后，室温下搅拌24 h.反应液用醋酸乙酯稀释后，再用水洗，无水硫酸钠干燥，减压除去溶媒，残渣用硅胶柱(CHCl₃-MeOH=19∶1)层析精制，得到无色油状的羟基琥珀酰亚胺酯即半抗原A(20.1 mg，收率为73.3%).

2.2.2半抗原B的制备

称取衍生物SA 83.3 mg(0.12 mmol)，溶解于CH₂Cl₂(3 mL)中，依次加入N-羟基琥珀酰亚胺21.5 mg(0.19 mmol)，DCC 31.7 mg(0.19 mmol)，室温下搅拌24 h，过滤，减压除去溶媒，残渣用硅胶柱(CHCl₃-MeOH=19∶1)层析精制，得到无色油状的羟基琥珀酰亚胺酯即半抗原B(61.5 mg，收率为64.9%).［α］²⁰_D-1.4°(C=1.7，CHCl₃).IRν^KBr_max cm^-1：3480(OH)，1780，1720()，1600，1582，1455(—C₆H₅).¹H-NMR(CDCl₃)δ：1.14(3H,t,J=7.0 Hz，N—CH₂—CH₃)，3.19(3H，s，6—OCH₃)，3.28(3H，s，1—OCH₃)，3.30(3H，s，18—OCH₃)，3.76(3H，s，16—OCH₃)，3.14(1H，C₆—H)，4.89(1H，d，J=5.5 Hz，C₁₄—H)，7.44～7.49(2H)，7.56～7.60(1H)，8.02～8.04(2H)(—C₆H₅)，2.86(4H，s，8-succinimidyl).¹³C-NMR(CDCl_3<