摘要基因表达差异的比较分析是在转录水平上鉴别组织或细胞间基因表达与否和基因表达量差异的技术，是揭示生物体发育和分化机理最有效的途径，在疾病相关基因分离等研究领域有极广泛的应用，是基因组学研究的核心领域之一。正确理解与合理组合利用已有的比较分析基因表达差异的技术是有效分离新基因的基础。

中图分类号：Q 344⁺.13文献标识码：A

文章编号：1004-4337(2000)03-0210-03

组织或细胞中基因表达状况主要包括表达基因集合(即表达基因的种类和丰度)和蛋白质集合(即双向电泳、质谱、微量蛋白氨基酸测序等揭示的蛋白质种类和比例)两方面。本文评述的主要是描述表达基因集合和比较表达基因集合间差异以分离差异表达基因的方法和技术。这些技术都是在mRNA层次上进行的比较分析，可分为杂交依赖型、PCR依赖型和测序依赖型三种。

1传统方法

比较基因表达差异的第一项技术是northern吸印杂交(Northern blotting)^［1］。即用同位素标记的DNA或RNA探针与吸印在滤膜上的被分析样品总RNA杂交，根据杂交信号判定已知基因在被分析样品中表达与否或表达量的技术。近三十年过去了，该技术在分子生物学领域仍然有极广泛的应用，任何基因的表达都要用它来证实。第二项比较基因表达差异的技术是核酸酶保护分析(RNase-protection assaying)^［2］。用标记好的被检测基因与样品总RNA杂交，由于单链特异的核酸酶不能降解mRNA/DNA杂交双链，用核酸酶降解后电泳，就能检测到被保护的也是被检测基因对应的mRNA的存在。之后，嗜菌斑原位杂交(Plaque-filter in-silu hybridization)^［3］用于分离cDNA文库中的目的基因。这些技术的一个共同点就是只能对已知基因进行鉴别分析。

削减cDNA文库构建技术(Subtractive cDNA library)^［4］使基因表达差异的比较有了质的飞跃。用过量参比材料cDNA与被分析材料总mRNA杂交，分离不能形成杂交双链的mRNA并用于构建cDNA文库，就能分离出那些在被分析材料中特异表达的全部基因。该技术最重要的改进是差异表达基因的选择扩增。把被分析材料(Tester)的双链cDNA用限制性内切酶消化，连上有生物素末端的接头序列，用过量的参比样品(Drive或Control)cDNA与之杂交，用单链DNA酶降解不能复性的接头序列，在生物素帮助下分离被分析样品特异cDNA片段的杂交双链，再经PCR扩增，就能获得大量被分析材料中特异表达基因的片段。这是因为只有被分析样品特异表达的基因才能形成两端都有接头序列的双链DNA而使接头不被降解，从而能被接头序列引物有效扩增。

2差异展示(Diffcrential Display)

差异展示^［5］是一种方便、快捷，能一一比较多个样品基因表达差异的技术。由于灵敏度极高，发育时期的微小不同步、微量组织细胞不一致等都能造成大量的带纹差异，从而使真正差异表达基因的鉴别非常困难。同时，污染的基因组DNA也能因随机引物的使用在PCR扩增中产生带纹，造成严重的干扰。因此，样品必须用DNA酶处理，以获得高纯度的RNA。

图1是该方法的基本程序。在逆转录酶作用下，用具有两到三个碱基尾端的锚定引物(如T₁₁XY,X=A/C/G;Y=A/C/G/T)合成cDNA，然后用锚定引物和随机引物的组合进行PCR扩增，在序列分析胶上带纹的有无和强弱就是不同材料中基因表达差异的体现。洗脱、再扩增、克隆和测序差异带纹，就能分离出大量差异表达基因的不完整序列并可作为进一步分离基因的探针。在鉴别和分离发育分化相关基因和疾病形成相关基因等方面差异展示获得了极成功的应用。该技术具有能同时对多个样品进行相互比较和需要的RNA起始量非常微小等优点。

图1差异展示技术的基本原理

为了消除对一个cDNA分子的多段扩增和重叠扩增，在T₁₁XY的前端再加上一段序列，逆转录获得的cDNA群体的3端就带上了一段相同的序列。对cDNA进行限制性酶切后，在5端加上一段接头，用接头和3端多出的一段相同序列对cDNA片段进行扩增，就能没有任何偏爱的获得所有cDNA的3末端片段。比较差异表达基因cDNA 3末端限制性片段也是比较基因表达差异的一种方法。尽管假阳性带是差异展示的弱点，但它仍然是比较基因表达差异最有效的方法。

3绝对差异分析(Representational Difference Analysis,RDA)

RDA^［6，7］最初是为分离基因组特有的DNA序列而设计的，后来被用于基因表达差异的比较分析。它结合了PCR技术和削减杂交技术的优点，能极有效地分离在一个cDNA群体中存在而在另一个群体中不存在(绝对差异)的基因序列，但对那些在表达量上有差异的基因的鉴别和分离却较困难。一般期望被分析样品含有特异表达的基因，但经常做交互分析，即先确定一个样品为被分析样品，然后交换，把参比样品作为被分析样品再做一次分析。把被分析样品(Tester)和参比样品(Driver或Control)的mRNA群体逆转录成cDNA，再用高频切点限制性内切酶消化并在cDNA限制性片段两端连上接头序列，经PCR扩增，就能获得足够量cDNA群体的限制性片段。把接头序列从cDNA片段的两端酶切掉，再给被分析样品加上新接头序列，这样就只有被分析样品的cDNA片段两端有外加的接头序列。用1∶100比例混合的被分析样品和参比样品cDNA片段做模板进行PCR扩增，过量的参比样品cDNA片段在复性时很快与被分析样品的相同序列杂交而阻碍扩增，只有被分析样品中特有片段获得有效的扩增。RDA的最大优点是能富集被分析样品特异表达的cDNA片段。为了达到更好的富集效果，通常要进行第二轮甚至第三轮操作。RDA在分离发育、分化、疾病等相关基因上出获得了极成功的应用。差异展示和RDA都是普通实验室比较基因表达差异的最佳技术。最近还发表了一种与RDA十分类似的阻遏削减杂交技术(Suppression subrtactive hybridization,SSH)^［8］，在基因表达差异的比较分析中获得应用。SSH能不受基因表达量的限制，无偏比较所有表达的基因。

4表达基因标签(Expressed Sequence Tags)

标签是能说明事物特征的一方纸片，而标志是能代表事物特性的组成部分。基因标签在基因内是基因的一小段序列，是基因的组成部分，但它又是我们用于唯一标识它对应基因的一段碱基符号。基因标签是标志和标签二位一体的一小段DNA序列。细胞或组织表达基因集合决定它们基本的生物学功能和特征。由于微生物、叶绿体、线粒体等基因组小，鉴别基因差异可以通过全序列测定进行。虽然不容易，但毕竟获得了许多细菌基因组的全序列。有许多真核模式生物基因组计划在执行中，但全序列的测定还有很长的路要走。随便对一个真核基因组全序列进行测定是不可想象的事。为了在具有重复序列、基因又是间断排列的庞大真核基因组中鉴别基因，随机测序大量不同组织的cDNA片段，即ESTs^［9,10］，就是一种变通的方法。虽然有些盲目，但在现有测序技术前提下，与全基因组测序相比仍然要简单可行得多。该方法的应用使各种基因数据库极大地丰富起来，也提供了被分析组织和细胞中表达基因集合的信息，为进一步研究打下了基础。

ESTs最明显的特点就是能帮助在基因组序列上分辨编码区。相互交叠的ESTs还能被组装成串，从而确定完整的基因编码序列。在不远的将来，人类基因组等有望获得全序列的测定，ESTs数据库将有助于把编码基因的序列同非编码序列分开。ESTs的最佳用途是根据数据盘上的序列资料比较基因表达差异。与已知组织或细胞的ESTs数据库比较，就能鉴别出被分析材料中特异表达的基因。受仪器、经费和测序技术的限制，ESTs在中小型实验室或较小的研究计划中很难获得应用。

5表达基因标签串分析(Serial Analysis of Gene Expression,SAGE)

SAGE^［11］是通过比较序列信息来比较基因表达差异的技术。它能用少数几个测序反应获得不同组织或细胞基因表达差异的全部信息。SAGE包括每个表达基因独有的10到14碱基标签序列的获得，能用于克隆和测序的基因标签串的组装和标签种类和频率的统计三个基本步骤。根据标签的种类和频率就能推论各标签对应基因的表达情况。

获得基因标签序列的过程非常复杂。首先用具有生物素末端的寡聚dT引物把mRNA逆转录成cDNA，再用高频切点的限制性内切酶(如4碱基酶)消化cDNA，然后，通过生物素与覆盖在玻璃珠上的链霉抗生物素蛋白结合把cDNA的3端片段与其它片段分开。这一步用的酶叫锚定酶(Anchoring enzyme,AE)，它的识别序列就是基因标签的一部分。获得cDNA的3端后，把它分为A和B两份，在它们的锚定酶切点上分别连上不同的序列A和B。A和B含有引物部分、标签产生酶(Tagging enzyme,TE)识别位点和因连接而重建的锚定酶识别位点三部分，其中引物部分是不同的。最巧妙的就是TE的选择。TE也是限制性内切酶，与一般限制性酶不同的是它的识别位点与切割位点相距一定数量的碱基，除了碱基数量一定外，识别位点与切点间的碱基组成是任意的，如Fok1的作用位点就是5GGA TGN NNN NNN NNN NNN3。用TE消化、混合并连接，就能产生两端分别是A和B的双标签(Ditag)。在A和B中，紧接TE识别序列的是AE识别序列，如果AE识别序列<