摘要 采用锥蓝-茜素红联合染色和酶组织化学染色技术，对经过甘油干 燥保存1、3、6个月的猫角膜内皮细胞进行活性检测。结果显示保存不同时期的角膜内皮 细 胞经锥蓝-茜素红联合染色后，细胞核均深度蓝染，蓝染率100％，细胞边界不清晰。经 组织培养7天后，细胞核蓝染率仍为100％。ACP、ATPase、SDH和苹果酸脱 氢酶在各时期保存角膜内皮细胞中均可检测到。保存1、3个月角膜中，四种酶与正常对比 无明显差异（P＞0.05）。而保存6个月组，除ATPas e外，其余三种酶反应程度降低（P＜0.05）。干燥保存角 膜培养7天后，内皮细胞中均未再检测到酶活性，认为 经甘油干燥保存的角膜内皮细胞不再具有活性。

中图分类号：R77.4文献标识码：A

Abstract To observe whethe r the corneal endothelial cells preserved by g l ycerol-desiccating have activities the c at corneal endothelial cells preserved f or 1，3and 6 months were actively stained by 0.25％ typan blue with1％ alizarin reds respectivly.At one time，four enzymes in the corneal endothelial cells were detec ted by enzyme histochemical staining tec hnology.The results showed all nucleus o f the endothelial cells preserved for va rious duration appeared heavey blue afte r staining by typan blue with alizarin r eds.The endothelial hexagonal cellular b orders were not clear.When cultured for 7 days，all nucleus were still heavey blu e stained.Under enzyme histochemical，ACP ，ATPase，SDH and Malate dehydrogenase wer e detected in the endothelial cells pres erved for various duration.Compared wit h the fresh group，the reaction level of the cells preserved for 1 and 3 months s howed no significant differences（p＞0.05） .While the cells preserved for 6 months presented lower level（p＜0.05）except the ATPase.Cultured for 7 days，there were no reaction in the all preserved cells.We concluded the corneal endothelial cells p reserved by glycerol-edesiccarting had n o activities.

Key words Endothelial cell ，Cornea desiccation Tissue-preservation Enzyme-histochemiology

多年来，干燥保存的角膜片一直被认为已失去角膜活性，只作为板层角膜移植材料的来 源。 但近年来，国内有学者提出干燥保存的角膜片，内皮细胞有存活的可能，并尝试应用于穿透 性角膜移植。本研究采用锥蓝-茜素红联合染色和酶组织化学染色技术， 对经过甘油冷冻保存的猫角膜材料进行内皮细胞活性检测，以探讨干燥保存角膜的活性可能 。

1资料与方法

1.1一般资料健康家猫20只，猫龄4～6个月，体重1.5～2.5kg，雄雌不 限。

1.2方法①眼球的甘油干燥保存：将动物处后立即无菌摘除眼球，共40只。1：5 000柳硫汞、1：2 000庆大霉素溶液各浸泡眼球15分钟。随机分为四组，分别为新鲜组、保存1、3、6 个月组，每组各10只。将消 毒的医用无水甘油40ml置于100ml无色消毒广口瓶 内备用。无菌操作下将眼球放该甘油中，4℃脱水24小时。更换甘油后，放4℃冰箱中长 期保存。②眼球的复水、复温、复形：将眼球自甘油中取出，在1：1000庆大霉素溶液 中室温下浸泡30分钟，最后在无菌条件下将生理盐水溶液自视神经残端注入眼内，使之复 形 。将复水之眼球带20mm巩膜瓣剪下角膜。③角膜片的培养：每组中随机取5只角膜片在 含10％的小牛血清的DMEM培养液培养7天。④角膜内皮细胞锥蓝-茜素红染色。⑤角 膜内皮细胞铺片：Corney氏液固定角膜片过夜，蒸馏水充分水合1 0分钟，显微镜下 将角膜内皮细胞层剥下，铺在经APES处理过的载玻片上。每只角膜片制成8张铺片。4 0℃温箱中过夜、干燥。⑥酶组织化学染色：每组角膜片各取5只铺片进行酸性磷酸酶（A CP，Gomori铅法）、琥珀酸脱氢酶（SDH，Nachlas硝基四氮蓝法）、A TPase（活性钙钴法）和苹果酸脱氢酶（Nachlas硝基四氮蓝法）染色，记录染 色颗粒大小。

2结果

2.1茜素红-锥蓝染色新鲜猫角膜内皮细胞呈六角形镶嵌排列整齐，内皮细胞活性率 （ 93.2±3.3）％。培养7天后，内皮细胞边界仍清晰，呈六角形 ，内皮细胞活性率（ 91.7±4.1）％，培养前后两者无显著性差异（t＝6.2，P＞0.05）。保存 1、3、6个月组内皮细胞均边界不清晰，细胞核深度蓝染，呈圆形，蓝染率均为100％ 。保存各组角膜片经培养7天后，角膜内皮细胞边界模糊不清，细胞核深度蓝染，蓝染率为 100％。

2.2酶组织化学染色①新鲜角膜内皮细胞中可见ACP、ATP ase、SDH和苹果 酸脱氢酶的活性表达。培养7天后，内皮细胞中仍可检测到四种酶的表达，且反应程度与培 养前无明显差异。②保存1、3、6个月组角膜片中均检测到四种酶的表达。其中，保存1 、3个月组四种酶反应程度与正常新鲜角膜无显著性差异（P＞ 0.05）；保存6个月组，ACP、SDH、苹果酸脱氢酶反应程度与正常新鲜角膜差异 显著（P＜0.05），ATPase反应程度与新鲜组无显著 性差异（P＞0.05）。保存1、3、6个月组角膜 片培养7天后，均未检测到四种酶的活性反应。③阴性对照组均无酶活性表达。

3讨论

近年来，张廷钺等^［1，2］对用干燥保存的兔、猴角膜形态和超微结构进行了观察 ，发现干燥保存的角膜六 角形细胞边界不清，但核的形状及分布密度与新鲜者无区别；电镜下干燥保存的角膜六角形 镶嵌状细胞边界看不到，但细胞轮廓可见，无核溶解现象，细胞膜上还可看到微绒毛。他们 对保存的角膜进行了一系列穿透移植实验，在部分实验动物中获得透明愈合。因此认为干燥 保存的角膜片，由于内皮细胞代谢活动处于停顿状态，内皮细胞不再受代谢毒性产物的影响 ，故不会发生细胞变性等不可逆的改变，仍有可能具有活性。

锥蓝是一种活性染料，当细 胞膜有损伤或破裂后，细胞核被染成蓝色，从而判定细胞的活性。我们将甘油冷冻保存1、 3、6个月的角膜片各5只用锥蓝-茜素红联合染色，发现内皮细胞虽然排列规则，与正常 新鲜角膜类似，呈六角形，细胞核存在，但胞核均深度蓝染，表明细胞膜已受到严重损害。 经培养7天后，细胞膜发生融解现象，细胞核深度蓝染。进一步表明细胞膜内的这种损害已 不可逆。干燥保存虽然仍能维持保存组织的结构完整，但细胞仍受到了不可逆的损伤。这种 损伤已超过了细胞的承受能力，导致细胞死亡。

酶是细胞完成新陈代谢和维持各项功能的 重要物质。正常细胞中由于脂膜的选择渗透作用，将各种酶局限在特定部位。细胞死亡后， 脂膜的屏障作用破坏，酶通过细胞膜泄漏丢失。Robbins实验证明，角膜内皮细胞死 亡后2小时，酶活性就全部丧失。因此，可以通过检测细胞内酶的活性判定细胞的活性。已 经证实^［3］，角膜内皮细胞中含有丰富的苹果酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、中等量的 酸性磷酸酶和少量的ATP酶。本实验显示，经干燥保存后，每组角膜内皮细胞中仍可检测 到各种酶活性的存在，其中保存1、3个月组甚至与正常组无明显差异，而保存6个月组除 ATP酶外，其余三种酶活性较正常组低。说明干燥保存可以保留酶的活性，但随时间延长 ，酶活性降低。具有酶的活性是否意味着细胞仍具有活性呢？于是，我们将保存角膜片培养 7天后再行酶组化染色，发现角膜片中无1例再具有任何一种酶活性，而新鲜角膜经培养7 天后酶活性与培养前无明显差异。从而证明，保存的角膜内皮细胞已死亡，培养过程中酶发 生了泄漏。

在干燥保存过程中，脱水、复水时引起细胞内外渗透压的变化，是导致细胞损 伤的重要原因。目前对这种渗透性损伤的机理尚不清楚，但认为与以下因素有关：①水在向 细胞内外移动时，与水通道之间的磨擦力引起细胞膜的损伤^［4］；②细胞脱水皱缩 时，细胞膜与细胞骨架之间产生作用力，引起损伤；③水分大量外移，细胞内溶质浓度不断 升高，产生“盐害”，使细胞膜的结构遭受不可逆的改变；④低温脱水时，生物膜的通透性 增高，导致某些溶质的泄漏，特别是钠钾离子的大量渗漏，降低了膜的稳定性；⑤复水时细 胞迅速肿胀引起细胞膜机械性破裂。因此，为了避 免和减少渗透性损伤的发生，在超低温冷冻保存角膜片时，基本原则就是在添加保护剂和去 除保存剂时，分步进行，逐渐变更细胞内外的渗透压，可以提高内皮细胞的存活率。

参考文献

1，张廷钺，于纯智，马吉献，等.应用干燥保存猴角膜对猴眼部分穿透角膜移 植实验研究.眼科研究，1992，10（2）：79.

2，邱孝芝，金袖云，胡麒伟，等.甘油冷冻保存眼球的实验研究与临床应用. 实用眼科杂志，1994，12（7）：394.

3，孙为荣，王传富，牛应筠，等.深低温保存角膜内皮细胞酶组织化学观察. 眼科研究，1991，9：1.

4，MuldrewK，McGannLE.Theosms ticrupturehypothesisofintrscellular freezinginjury.BiophysJ.1994，66：532～54 1.

（2000-04-02收稿）