摘要应用RT-PCR法检测庚肝病毒（HGV）RNA，并对阳性扩增的产物采用PCR技术片段直接克隆法测定。结果从86例输血后丙型肝炎（PTH-C）患者血清中检出HGVRNA阳性者31例（36.0％），其中1例HGVNS5区部分核苷酸序列与美国原始株（u44402）和另1例日本株（d87255）核苷酸同源性比较分别为86.0％和84.0％。证实山东地区PTH-C患者存在着HGV感染和HGV／HCV混合感染，但是否存在不同亚型或HGVRNA阳性携带者，尚有待进一步证实。

Abstract To detect the HGV infection in Post-transfused hepatitis C（PTH-C）patients in Shandong and sequencing of partial HGV gene，RT-PCR was performed to amplify the HGV gene from sera of PTH-C patients.One clone was sequenced from a PCR product.Results showed that of 86 patients with PTH-C，31 patients were HGVRNA positive（36.0％）.One clone（358bp）from a patient with HGVRNA was sequenced.Compared with other HGV isolates the homology of partial HGV gene of Shandong′s isolate，Was 86.0％ with American isolates（u44402），84.0％ with Japan isolate（d87255）respectively.The conclusion is HGV infection exists in Shandong.HGV and HCV confection are often seen.The significance of genetic variation of HGV from different area and carriers remains to be determinated.

Key words Post transfused hepatitis C Hepatitis G virus Nucleotide sequence

庚型肝炎病毒（HGV）是Simons^［1］等1995年在非甲非戊型肝炎患者血浆中发现的一种与输血有关的新型肝炎病毒。为探讨山东地区输血后丙型肝炎（PTH-C）HGV感染和同HCV重叠感染状况及山东株HGV基因变异的情况，我们对来自鲁南地区86例PTH-C患者血清进行RT-PCR检测，并对PCR扩增产物作HGVNS5非结构区部分核酸序列测定。现报告如下。

1资料与方法

1.1研究对象本组86例PTH-C患者血清均来自我省泰安、莱芜、临沂、枣庄、菏泽和济宁地区，系1995～1998年间有输血或输血制品史在本院住院和门诊长期随访患者。其中男54例，女32例；年龄16～54岁，平均23.6岁。86例均符合1995年北京第五次全国传染病寄生虫病学修订诊断标准，并经临床和病理确诊证实。

1.2引物设计与PCR扩增采用半巢式PCR技术扩增中国山东株的HGVNS5区部分基因片段。根据中国株HGV5′端非编码区序列设计引物。

外引物序列为P₁／P₂，

P₁：5′-TGGTGAT GGACTGAACAGCTGG-3′；

P2∶5′-GGAGTTGTCCTGTTGACGAAG-3′。

内引物序列为P1／P3，

P3∶5′-AAAGGGGCCACTGATT-3′。

经两轮扩增后在1.5％琼酯糖胶电泳上扩增到长度为358bp。

1.3PCR产物纯化及克隆测序从琼脂糖凝胶电泳中回收PCR产物，纯化后直接与载体进行连接，转化XL₁-Blue菌中，鉴定后提取质粒DNA，并采用ABI373自动测序仪对HGVRNA的RT-PCR产物进行核苷酸序列测定。

2结果

2.1HGVRNA检测山东地区86例PTH-C患者血清中，HGVRNA阳性检出率为36.0％（31／86）。

2.2中国HGV山东株（Shan02）与美国、日本株部分序列比较中国山东株HGV5′非编码区扩增的PCR产物为358bp，序列分析核苷酸同源性结果见图1。该株序列同源性与美国株（u44402）和日本株（d87255）相应位置核苷酸同源性分别为86％和84％。与上述国外两株已发表的氨基酸序列同源性均在90％以上。

图1HGV山东株部分cDNA序列（358bp）与已发表HGV株序列比较

3讨论

HGV感染呈全球性分布，可以感染多种人群，特别同HCV重叠感染率较高，但单纯HGV感染后庚型肝炎和慢性肝炎病例并不多见，为实验研究工作带来较大困难。现已公认庚型肝炎同丙型肝炎一样都以输血或输血制品传播途径为主，因此HGV／HCV重叠感染现象临床十分常见。本组根据HGV5′端非编码区相对保守特点设计引物，可以提高检测的灵敏度，减少假阴性，这在临床检测和流行病学调查中有重要的意义。利用RT-PCR方法从86例PTH-C患者血清中提取HGVRNA，阳性检出率为36.0％（31／86），另对1例有6年输血史PTH-C患者血清中PCR扩增产物基因片段直接循环法序列测定，直接克隆出中国山东株HGVNS5非结构区358bp，该株序列为中国山东HGV第2株（Shan02），与美国株（u44402）和日本株（d87255）比较其相应位置核苷酸同源性分别为86％和84％，而氨基酸同源性均在90％以上，证实山东地区PTH-C患者存在HGV感染，而且有较高HGV／HCV重叠感染率。该株序列与已发表的美国、日本两株序列比较有较高同源性，同时也有一定的变异性，但无显著性差异（P＞0.05）。

目前对HGV感染诊断主要依靠对感染者血清中HGVRNA检测，因对HGV基因组全序列的了解有限，对HGV各种抗原的研究仍在进行。国外Leary^［2］等报道HGV长度为9125bp，Linnen^［3］报道HGV全序列为9392bp；国内周育森^［4］等首次克隆出中国人HGV全序列cDNA全长9128bp。但多数报告仅对少数病例进行部分核苷酸序列测定，对我们测定该株序列同国内外已发表多株序列比较是否属同一个基因型或同一个基因亚型还难以断言，因我们克隆的山东第2株HGV序列来自我国华东地区北部沂蒙山区，地区分布不同基因型别不同这与HCV基因变异十分相似。我国山东地区处于东部沿海地带，人口较稠密，该地区所存在HGV感染不同株分子状态，不同基因型别分布特点还需要更多序列进行比较以便更深入研究。

4参考文献

1，Simons JN，Leary TP，Dawson GJ，et al.Isolation of novel virus-lake sequences associated with human hepatitis［J］. Nature Med，1995，1（6）：563～569.

2，Leary TP，Muerhoff AS，Simons JN，et al.Sequence and genomic organization of GBV-C：a novel Member of the flaviviridae associated with human non-A-E hepatitis［J］.J Med virol，1996：48：60～67.

3，Linnen J，Wages J Jr，Zhang kect ZY，et al.Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus a transfusion transmissible agent［J］.Science，1996，271（5248）：505～508.

4，周育森，王海涛，唐时幸，等.中国人庚型肝炎病毒（HGV）部分基因克隆和cDNA序列测定.军事医学科学院刊，1996，20（2）：160.

（2000-04-06收稿）