摘要目的：研究椎间盘纤维环中Ⅰ型和Ⅱ型胶原含量的变化与椎间盘纤维环病变的关系。方法：对正常组和病变组纤维环标本的Ⅰ型Ⅱ型胶原含量用盐析法进行测定，并用聚丙烯酰胺凝胶电沪(SDS—PAGE)进行分型鉴定。结果：病变组Ⅰ型胶原含量＜正常组Ⅰ型胶原含量，P＜0.05；病变组Ⅱ型胶原含量＜正常组Ⅱ型胶原含量，P＜0.05。SDS—PAGE证实本组测定物为Ⅰ型和Ⅱ型胶原。结论：椎间盘纤维环中Ⅰ型和Ⅱ型胶原含量下降是引起纤维环退变、变性的重要原因之一。

腰椎间盘退变、突出症的发生与椎间盘基质中胶原的代谢变化有关。九十年代初以来，国内李书忠等^［1］对腰椎间盘胶原总量进行了测定。鉴于对正常和病变椎间盘纤维环中胶原分型测定有待于深入研究，本文用生化测定的方法对其进行了实验测定研究，并对胶原代谢的变化进行了探讨。

1材料和方法

1.1取材：正常纤维环标本取自于急性脑外伤死后的新鲜尸体，共7例34个(L₁—L₅)均为男性，平均年龄26.9岁。病变纤维环标本取自腰椎间盘突出症手术患者，共29例35个椎间盘组织(L₃—L₅)，其中男20例，女9例，平均年龄27.4岁。标本取出后用0℃生理盐水洗净，小玻璃瓶密封-30℃短期保存。

1.2胶原提取^［2］：将正常组和病变组纤维环标本分别称重，切碎后放入试管，加入1M NaCl的Tris-HCl缓冲液3ml，4℃下制成乳白色匀浆，搅拌过夜。次日加入NaCl至终浓度为2M，4℃静置4小时，以15000r/min离心15分钟，上清液留作制备标本Ⅱ液用，沉淀物加6M HCl 1ml于安瓿中，加双蒸水1ml密封，100℃消化水解12小时，重复离心，取上清液为标本Ⅰ液。

将前述留置的上清液加NaCl至终浓度为4M，4℃静置过夜，以15000r/min×15min离心，静置过夜，并重复离心，取沉淀物加6M HCl 1ml，加双蒸水1ml于安瓿中封口。100℃消化水解12小时，重复离心，取上清液为标本Ⅱ液。

1.3胶原分型含量测定：(1) 将标本Ⅰ液和Ⅱ液上样，经聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)证实，有α₂(Ⅰ)、α₁(Ⅰ)、β和γ区带的为Ⅰ型胶原；有α₁(Ⅱ)、β和γ区带为Ⅱ型胶原。(2) 将标本Ⅰ液和Ⅱ液用氯胺—T法^［2］测定Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原含量。(3) 统计分析：计算正常组和病变组纤维环中Ⅰ型和Ⅱ型胶原测定值的均数±标准差(x±s)，并对正常组和病变组均数间有无显著性差异作t检验。

2结果

2.1胶原分型鉴定：标本Ⅰ液经SDS—PAGE电泳，有4条区带为Ⅰ型胶原，见图1a；标本Ⅱ液电泳图，有3条区带为Ⅱ型胶原，见图1b。

图1：a.正常纤维环Ⅰ型胶原。b.病变纤维环Ⅰ型胶原。

c.正常纤维环Ⅱ型胶原。d.病变纤维环Ⅱ型胶原。

2.2正常组和病变组中Ⅰ型和Ⅱ型胶原的含量(g/100g湿重纤维环)：正常组纤维环Ⅰ型胶原为6.48±3.54＞病变组Ⅰ型胶原4.79±0.91，P＜0.05；正常组Ⅱ型胶原11.76±3.98＞病变组Ⅱ型胶8.68±1.33，P＜0.05。正常组Ⅱ型胶原含量＞Ⅰ型胶原含量，P＜0.05；病变组Ⅱ型胶原原含量＞Ⅰ型胶原含量，P＜0.05。

3讨论

3.1纤维环的功能：椎间盘由髓核、纤维环和上下软骨终板组成，椎间盘主要生理功能为承重、吸收震荡，并将作用于椎体的外力向各方向均匀地传递给纤维环。纤维环可限制椎体间异常运动，维持椎体和韧带结构的解剖关系，在压力和扭转外力作用下纤维环有抗张力性能^［3］，保持椎间盘的容积，防止髓核突出。

3.2纤维环胶原分布：椎间盘纤维环基质中主要成分为水、胶原蛋白、蛋白多糖、弹性蛋白和少量矿物质等。其中水占60～70%，胶原含量占其干重的60%，蛋白多糖占其干重的20%^［4］。迄今为止在人正常椎间盘内已发现含有8种胶原^［5］，其中绝大部分为Ⅰ型和Ⅱ型胶原，少量的Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅸ型胶原在椎间盘中的作用尚未完全阐明^［6］。

3.3纤维环中胶原的构成和功能：Skaggs在实验研究中发现外层纤维环主要含Ⅰ型胶原，而由纤维环外层向内层Ⅰ型胶原逐渐为Ⅱ型胶原所取代，并认为主要是由Ⅰ型胶原构成的组织(如肌腱、韧带、半月板等)较Ⅱ型胶原构成组织有更高的张力强度^［3］。本实验结果证实纤维环中主要由Ⅰ、Ⅱ型胶原构成，纤维环中胶原纤维斜向排列，构成板层状结构，相邻板层互相紧贴以构成纤维环^［7］。另外蛋白多糖与水结合在纤维环板层中沉积，具有粘性，有利于板层间的滑动。

3.4病变机理：本实验结果发现病变纤维环中Ⅰ型和Ⅱ型胶原的胶原含量以及Ⅰ/Ⅱ胶原比例下降与Skaggs的结果较接近；而纤维环中Ⅱ型胶原含量高于Ⅰ型胶原与Kaapa^［8］，Sedowefia^［4］报告相仿，与国外部分实验报道不全相同，可能与实验方法选择、取材部位(本实验取自腰椎间盘突出处的纤维环，而非正常处)等实验条件不同有关。

Ⅰ型和Ⅱ型胶原含量的下降使纤维环胶原纤维的稳定性下降；此外还有实验证实变性椎间盘(含纤维环)中蛋白多糖和水含量下降，髓核易于突出。

胶原蛋白肽链在纤维环中呈三螺旋构造排列(triple helical configuration)，胶原蛋白代谢受胶原蛋白酶的调节。正常情况下，椎间盘细胞合成的胶原酶和胶原蛋白相互结合，以酶原等潜伏状态存在，保持较低的活性调节胶原代谢。当局部病变时，潜伏状态的胶原酶被激活，使胶原蛋白分解加剧，尽管椎间盘细胞可合成胶原蛋白，但多为非成熟的胶原，纤维环的抗张力性能减退，易于破裂，髓核变性突出。

总之，本研究认为椎间盘纤维环中Ⅰ型和Ⅱ型胶原含量下降是引起纤维环退变、变性的重要原因之一。

参考文献

1，李书忠，胡有谷，陈培勋.腰段椎间盘不同节段不同区域的胶原定量研究.中华外科杂志，1994；32(11)：670—672

2，方得福，周吕，丁濂等.《现代医学实验技巧全书》。第一版，北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1995；12：684—688

3，Skaggs DL，Weidenbaum M，Latridis JC，et al．Regional Variation in tensile propertie and biochemical composition of the human lumbar anulus fibrosus．Spine,1994，19(12):1310-1319

4，Sedowofia KA，Tomlinson IW，Weiss JB，et al．Collagenolytic enzyme systems in human intervertebral disc．Spine．1982，7(3):213-221

5，Kaapa E，Zhang LQ，Muona P，et al．Expression of type Ⅰ，Ⅲ and Ⅳ collagen mRVAs in experimentally injured porcine intervertebral disc．Connective Tissue Research，1994，30:203-214

6，Robers S，Menage J，Duance V，et al．Collagen types around the cells of the intervrtebral disc and cartilage end plate:An immunolocalization study．Spine，1991，16(9):1030-1038

7，Bernich S，Walker JM，Paule WJ．Age Changes to the anulus fibrosus in human intervertebral discs．Spine，1991，16(5):520-524

8，Kaapa E，Han XY，Holm S，et al．Collagen synthesis and types Ⅰ，Ⅲ，Ⅳ and Ⅵ collagens in an animal model of disc degeneration．Spine，1995，20(1):59-67

收稿日期：2000-03-08