【摘要】目的神经肽与经典神经递质共同参与着神经系统突触间信息传递，同时脊髓损伤部位神经肽的变化与神经细胞继发性改变也有密切关系，因此探讨脊髓损伤后中枢神经肽的变化对进一步阐明中枢与脊髓之间关系非常有益。方法将Wistar大鼠手术处理后分为脊髓压迫组、挫伤组、离断组、假手术组、正常对照组。术后24小时心内灌注取脑，再冠状面分区切取不同部位脑片，常规操作进行β-内啡肽和神经肽Y免疫组化反应。结果损伤组β-内啡肽阳性表达明显高于对照组，脊髓横断组比其他两组更高；神经肽Y阳性表达明显低于对照组，脊髓横断组比其他两组更低。结论（1）脊髓损伤对大脑中枢神经肽的表达存在显著影响；（2）脊髓与中枢正常状态的神经联系中断对研究结果影响更加明显。

The changes of some neuro-peptides in the rat brain after spinal cord injury

XU Youjia，ZHENG Zugeng，YAO Ming，et al．

（Department of Orthopedics，the Second Affilated Hospital of Suzhou Medical College，Suzhou 215004）

【Abstract】ObjectiveThe changes of some neuropeptides were observed in brain slices of rats with spinal cord damage. MethodsThe experimental rats were divided into five groups：spinal cord occupied，contused，transected，false-operation groups and normal control．24 hours after operation，all animals were sacrificed，and brain slices produced．Then the immuno-histochemical reactions of β-endorphin and neuropeptide Y were observed．ResultsThe changes of the experiments were that the positive neurons were found to decrease significantly，with the transected group as the lowest．ConclusionThese results suggest that some neuroeptides in neurons of rat brain respond to the change of spinal cord．

【Key words】Spinal cord injuryNeuro-peptides

肾上腺素能神经元（释放NA）和胆碱能神经元（释放Ach）是神经信息传递的研究对象。随着神经系统神经肽（neuropeptides）的发现，针对神经肽功能以及通过神经肽变化来明确神经系统病理生理机制的研究越来越多^［1］；因而，在脊髓损伤领域，神经细胞继发性改变中神经肽的作用也有许多研究^［2］，但脊髓损伤后大脑中枢神经肽的改变尚无文献报道。应该说大脑中枢与脊髓之间存在着最为丰富、最为紧密的联系，脊髓损伤后大脑中枢神经肽的变化是脊髓损伤领域一个崭新的研究方向。本研究运用细胞免疫组化技术，了解脊髓损伤后大脑中枢β-内啡肽(β-EP)和神经肽Y(NPY)的表达情况，并结合文献探讨其变化意义。

材料与方法

一、实验动物与模型分组

正常成年雄性Wistar大鼠25只，分为：(1)脊髓占位压迫组；(2)脊髓挫伤组；(3)脊髓离断组；(4)假手术组；(5)正常对照组。每组5只大鼠，大鼠平均重量260±15g，由上海中科院动物所提供。

二、损伤模型

麻醉采用4％水合氯醛（10 ml／kg）腹腔注射，无菌消毒按Nystrom方法取背正中切口，咬除T₁₀或T₁₁椎板，暴露对应脊髓。损伤方式分组实施。占位组：将直径0.8mm、长4mm的无菌硬质塑料管经暴露的T₁₁硬膜外间隙推入T₁₀椎管后方^［3］。挫伤组：采用改良Allen氏方法，将直径2.0mm、重10g的金属棒（顶端加工成球面状）经8cm引导管滑下打击T₁₀段脊髓。离断组：在T₁₀脊髓后侧用锐利弧形刀片一次将脊髓横形切断，术中可见大鼠双下肢和尾部有强烈的痉挛反射。假手术组：在暴露T₁₀棘突并咬除椎板显露脊髓后即结束手术。

所有动物完成实验模型后均在一侧后肢上部肌注洁霉素0.3g；伤口分层缝合。

三、取材时间及方法

脊髓损伤后24小时将实验大鼠用4％水合氯醛（10ml／kg）腹腔注射麻醉，常规方式进行心内灌注，灌注后取出大脑置4％多聚甲醛固定。固定2天后将脑组织在11°斜角架上冠状面分割脑块（间脑、脑干上、脑干下）并进行常规石蜡包埋，择日按Paxinos和Watson图谱选择性石蜡块切片。

四、免疫组化反应

采用SABC免疫组化法染色。4μm石蜡切片按博士德公司单抗操作要求进行（药盒购自武汉该公司）：先滴加一抗，4℃过夜；再滴加二抗37℃孵育1小时；再滴加三抗（SABC），37℃孵育1小时；以上步骤之间用0.01M、pH 7.2PBS漂洗三次（每次3min），最后用DAB显色，苏木素复染，常规脱水、透明和封片。在Olympus BH-2型显微镜下观察并摄片。

结果

一、光镜下可见在下丘脑（弓状核）、丘脑室周、脑桥-延髓部部分核团、中央导水管周灰质等切片中，正常对照组神经元细胞β-EP和NPY呈阳性表达，高倍镜下神经元和部分神经胶质细胞胞浆内可见棕褐色阳性颗粒。而在实验组切片中两种神经肽的表达明显与正常对照组不同。

二、在β-EP表达中，脊髓离断组神经元无阳性表达，脊髓占位组和脊髓挫伤组可见部分神经元存在阳性表达，阳性率比正常对照组低。

三、在NPY表达中，不同脑区切片中脊髓离断组神经元无阳性表达，脊髓占位组少量阳性表达，脊髓挫伤组阳性表达多于其他损伤组，但比正常对照组少。见封三图1～6。

图1NPY免疫表达中神经元阳性表现:细胞浆为棕褐色;其他胶质细胞胞浆也为棕褐色阳性表现。×10

图2NPY免疫表达中神经元阳性为中等程度,部分胞浆棕褐色不完全;其他神经胶质细胞胞浆也为不完全棕褐色显色。×10

图3NPY免疫表达中神经元和神经胶质细胞为阴性反应；胞浆内无棕褐色，均为蓝色显色。×10

图4β-内啡肽免疫表达中神经元为阳性：胞资浆呈棕色；神经胶质细胞胞浆也为棕色阳性显色。×10

图5β-内啡肽免疫表达中神经元为部分阳性：胞浆棕色呈不完全；神经胶质细胞胞浆也为部分棕色显色。×10

图6β-内啡肽免疫表达中神经元和神经胶质细胞为阴性反应：胞浆内无棕色显色，均为蓝色显色。×10

讨论

神经系统重要功能就是通过神经元突触进行细胞间信息传递，大脑中枢是如此；脊髓组织也是如此。神经系统大量存在的是化学性突触，在这类突触中跨突触的神经化学传递是神经信息传递的主要形式，经典的神经递质和逐渐发现的神经肽均是这类形式的主要组成部分。由于神经肽的生成与经典递质不同，许多生理学研究后认为电刺激频率高低与神经肽释放有关，同时还认为相同频率电刺激神经肽与经典递质释放机制存在差异；另外下丘脑肽能神经元活动规律也与神经肽释放关系密切^［1］。本研究结果显示脊髓不同损伤，脑内β-内啡肽（β-EP）和神经肽Y（NPY）表达与对照组存在差异，说明脊髓损伤的确引起中枢神经调节的变化。

一、β-内啡肽本研究结果提示三种损伤模型中下丘脑（弓状核）、丘脑室周、脑桥-延髓部，中央导水管周灰质区域β-EP阳性表达明显减少。损伤24小时时，离断组还与占位组、挫伤组之间脑内神经细胞阳性表达存在差异。已有研究认为在躯体应激反应中脑内β-EP明显升高，但若应激持续存在脑内β-EP及其相关肽类物质会很快变化^［1，4］。本研究中占位属应激持续存在状况，其他损伤为一过性机械损伤，尤其脊髓离断还导致神经传导束中断损伤；在这三种不同损伤中，离断模型组脑内β-EP未见神经细胞阳性表达，另外两种损伤模型组阳性表达可见，但比正常对照组少，这说明脊髓损伤后大脑中枢反应除了应激作用外，还可能下列因素相关：(1)已有研究认为伤害性刺激可激活下丘脑弓状核β-内啡肽系统，再通过中央灰质下行冲动抑制脊髓背角伤害信息传递。本研究中脊髓离断，24小时后脑内β-EP阳性反应消失，可能提示这与正常状态的脊髓传入信号完全消失有着密切关系；(2)脊髓损伤都是严重的中枢神经系统直接创伤，近年来许多研究认为β-EP与中枢神经免疫调节有关，特别又发现