自Kiley等（1958年）首次报告使用血液透析治疗肝衰竭以来，人工肝的研究已历经40多年。人工合成肝辅助装置（血液透析、吸附剂、血液灌注）和生物性肝辅助装置（肝体外灌流、人体交叉循环、血浆置换）虽能改善肝衰病人一些临床症状，但不能提高其生存率。近20年来，由于细胞培养技术的改进，出现了由人工合成材料和生物材料相结合的组合性生物人工肝支持系统（Hybrid Bioartificial Liver Support System，HBLSS）。近年来，该装置已用于动物和Ⅰ／Ⅱ期临床试验，取得良好效果^［1］。本文就HBLSS的研究进展作一介绍。

一、HBLSS的基本原理

把培养增殖的肝细胞置于HBLSS生物反应器中，患者的血液流经生物反应器时，通过容器内纤维素半透膜与培养的肝细胞进行物质交换，从而达到人工肝支持作用^［2］。

二、HBLSS的适应证

肝脏具有合成、代谢、解毒和排泄功能。HBLSS是将体外培养的肝细胞用于人工肝，使之具有更充足、完备的肝功能。它主要适用于（1）暴发性肝衰竭（FHF）：人工肝可对FHF患者进行支持治疗，并可分泌一些促肝再生的物质以促进肝细胞的再生和功能恢复；（2）肝移植的桥梁：通过支持衰竭肝能使肝衰竭病人过渡到肝移植；（3）治疗肝移植后的最初无功能（PNF）；（4）提高肝再移植的存活率；（5）肝叶切除术：术后用人工肝支持其功能，使病人渡过危险期直到肝组织再生；（6）终末期肝病：有可能防治慢性肝功能衰竭；（7）肝硬化病人非肝手术。

三、HBLSS的研究进展

HBLSS包括肝细胞、生物反应器和血浆灌流三部分^［3］。

1.肝细胞

维持机体正常肝功能运转至少需要30％的肝量。Matsmura（1987年）认为以正常成人肝重1500g计算，制备一个具有相似功能的生物人工肝至少需要25～75g肝细胞，相当于1.9×10⁹～5.6×10⁹个肝细胞。然而肝细胞不易在体外培养生长，在普通条件下，12～24小时即丧失其间隙连接结构，3～5天细胞呈扁平状，失去其特异组织功能，1～2周全部死亡。因此，需改进其培养方法以满足HBLSS的需要。

（1）肝细胞来源

HBLSS中的肝细胞不仅要求有特异的肝细胞功能，经培养可长期存活，来源广泛，产量高，而且应安全、无毒副作用。目前用于HBLSS的肝细胞来源于原代肝细胞和肝细胞系。

①肝细胞系

体外培养时，可无限增殖，易达到足够的数量和活力，高分化肝细胞更可保持正常肝细胞的许多特性，具有肝的特异性功能。现常用的人肝细胞系来源于肝脏肿瘤，如C3A来自肝母细胞瘤，CL-1来自高分化肝癌，CL-5来自肝癌旁组织，目前对这些细胞引起的危险和副作用知之甚少。可试图改变它们的基因以产生理想的稳定的肝细胞系并贮藏起来备用。

②同种肝细胞

理论上用正常人的肝细胞最为理想，然而体外培养的肝细胞很少再增殖，其数量及质量也有限，且来源困难。有报告将对温度敏感的变异的SV40大T抗原基因导入正常的人肝细胞可维持其分化能力，此外来源于正常人肝细胞的HHY41和HH25细胞系也能增殖分化较长时间^［4］。另有报告人胎肝分离的肝细胞培养上清中含有成分不明的细胞生长因子可以刺激离体细胞的生长增殖，因而其肝细胞组织分化能力强，可在体外继续分化增殖，且免疫原性弱，应为较好的肝细胞来源，但存在着伦理问题。

③异种肝细胞

通常应用猪、兔、鼠肝细胞，其中首选猪肝细胞，因猪肝大小和体重与人相似，猪的营养结构与人相仿，其生物功能也与人类似，且来源丰富，易大量获取肝细胞^［5］。Wang比较了猪肝细胞与C3A细胞用于HBLSS的效果，结果前者优于后者^［6］。但动物肝细胞细胞色素P450和其它酶的活力是否有种族差异、所合成的物质能否完全取代人的相应物质、异基因蛋白和酶进入血循环是否出现免疫反应和一些尚不清楚的动物源性疾病传播，仍需进一步研究^［7］。Nyberg研究发现中空纤维膜能降低猪肝细胞生物人工肝治疗中病毒传递的危险性^［8］。

（2）肝细胞培养

①肝细胞单层培养

在培养基质中加入聚乙酰内酯、胶原、生长因子、激素及与肝非实质细胞共同培养等可延长肝细胞寿命，有利于长期保持其活力和功能。缺点是这种系统要体积很大，方能容纳足够数量的肝细胞以满足HBLSS需要。

②肝细胞球形聚集培养

普通的培养方法仅能给肝细胞提供二维生长的表面，这将限制肝细胞的功能分化和生长调节，在体内肝细胞是处于一种三维环境中，细胞间相互作用能调节细胞生长的功能。球形聚集培养是利用某些方法如不断搅动悬液中的肝细胞防其贴壁或在悬液中加入表皮生长因子和胰岛素等促使肝细胞聚集成球形^［9］。问题是过大的球形聚集使肝细胞中心的细胞处于营养不良和缺氧环境而衰老死亡。

③肝细胞微载体培养

微载体大量的面积及面积-容量关系特别适合于在有限的培养体积内粘附大量的肝细胞，此外还可延长肝细胞的寿命，并维持其特异性功能^［10］。目前用于细胞培养的微载体中以Cytodex-3效果较好。不过使用微载体培养增加了HBLSS的体积和不便。

④肝细胞微囊包裹

微囊是一种人工合成的多聚结构，由藻酸盐-聚赖氨酸、聚丙烯酸酯或醋酸纤维素形成的超薄半透膜作为肝细胞外壳，可防止肝细胞逸出产生免疫反应，还可使肝细胞-血循环间物质交换自由进行，但免疫细胞、免疫球蛋白和补体成分因分子量大，无法进入囊内损害肝细胞。肝细胞与胶原基质微囊形成三维结构，并与非实质细胞共同培养，利用细胞间的相互作用增强肝细胞的活力、较长时间地维持肝细胞的功能。这种微囊肝细胞可维持6～8周的功能。但目前尚无临床应用报道。

（3）肝细胞的储存

目前采用的低温储存方法可较好地保存肝细胞的功能和活力，但解冻后其功能和活力均有下降^［11］。现今较好的肝细胞低温保存液为UW液，但其长期储存效果欠理想。

2.生物反应器

理想的生物反应器应包括以下基本内容（1）细胞培养技术：生物反应器不仅能为肝细胞提供较好的生存条件，以满足所需的肝细胞数要求，而且能提供足够的膜面积以供肝细胞的固定和培养；（2）膜的特性：应能去除血中的毒素并使肝的特殊因子返回到病人血中，达到较好的物质交换目的；并能使培养的肝细胞与宿主的免疫系统相隔离，阻止病人血中的抗体和免疫成分进入，保护植入的肝细胞不被宿主排斥。（3）生物反应器的相关性：膜的选择和内装的物质不应引起病人的生化和免疫反应。

现有的生物反应器有三种类型：中空纤维管型、平板透析型和血液灌流型，以前者应用最为广泛。它采用5000～10000多根多孔（孔径0.2μm）空心纤维细管平行排列，置于密闭箱内。它有两大优点：（1）使用的半透膜多为醋酸纤维滤膜和纤维蛋白修饰的聚砜滤膜^［12］。其膜可允许10万分子量以下的物质通过，而细胞及免疫球蛋白不能通过，起到免疫隔离作用；（2）在一有限的容积内提供最大的表面积供肝细胞粘附生长，有利于物质交换。根据培养方式分三类：（1）细胞培养在中空纤维细管内腔；（2）细胞培养在中空纤维细管外腔；（3）细胞培养在中空纤维细管编织的网间。目前以第二类应用最多。

有研究表明肝细胞的存活时间和功能与中空纤维细管的内径成反比，肝细胞更适合于生长在较细内径的中空纤维细管。

3.血或血浆灌流

为了辅助生物肝的解毒功能，目前临床上试用的HBLSS多是用血浆分离后通过活性炭或树脂来吸附毒性物质再灌注到中空纤维管中。Shi证明了FHF病人血浆可抑制肝细胞DNA、RNA和蛋白质的合成，因而主张FHF病人血浆需先减毒再进入生物反应器^［13］。

4.HBLSS的Ⅰ／Ⅱ期临床试验结果

美国和欧洲3个临床中心用猪肝细胞建立的HBLSS对39例FHF病人进行人工肝支持治疗，每个病人经过1～5次的支持，结果表明该系统安全有效。其中Watenabe报告^［3］31例，分别用于FHF（18例）、PNF（3例）和慢性肝病急性发作（10例），结果FHF（17例）、PNF（3例）病人成功地过渡到肝移植，对慢性肝病急性发作病人的病情也有暂时缓解作用。Sussman^［14］以C3A细胞系建立的HBLSS治疗11例FHF病人，最终4例过渡到肝移植。但也有作者报告其临床试验效果尚不如动物实验。最近美国食品与药物管理局（FDA）已批准进行猪肝细胞的HBLSS的Ⅱ／Ⅲ期临床试验，用FHF病人30天存活率来检测该系统的有效性。

5.用于人工肝支持系统研究的动物模型

（1）手术缺血性肝坏死动物模型

用杂种犬行门腔静脉端侧分流，24小时后关闭术中安放的血管阻断装置，阻断肝总动脉及胃、十二指肠动脉2小时^［15］。此模型所致肝坏死其生化指标及病理与临床急性肝坏死非常相似，是人工肝支持疗法研究较好的动物模型。