【摘要】目的探讨抑制热休克蛋白70（HSP 70）表达对脑胶质瘤细胞增殖及凋亡的影响。方法利用细胞培养、电子显微镜及流式细胞仪的方法，观察阻滞HSP 70表达后对肿瘤细胞生长的影响。结果体外培养脑胶质瘤细胞株，经不同浓度槲皮素作用不同时间后，碘化丙碇染色荧光显微镜观察发现细胞核固缩、致密和碎裂现象；流式细胞检测发现亚二倍体峰，提示出现细胞凋亡。分析细胞周期，发现凋亡细胞主要出现在G₀、G₁期，随药物的浓度增加而增加；观察细胞膜HSP 70蛋白表达，经槲皮素作用后细胞表面HSP 70表达显著受到抑制。透射电镜观察凋亡细胞出现核致密、核碎裂及核边聚现象。结论脑胶质瘤细胞广泛存在HSP 70过度表达，HSP 70可以作为判断肿瘤恶性程度及预后的一个参考指标；槲皮素可特异性抑制体外培养的胶质瘤细胞HSP 70的表达并诱导凋亡。

Study On the effects of inhibiting the expression on the proliferation and apoptosis of brain glioma cells

LI Hongfu，FU Zhen， ZHEN Zhaoxu,

(Department of Neurosuegery，The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，Nanjing, 210029)

【Abstract】ObjectiveIn order to examine the correlation between the expression of heat shock protein 70（HSP70）with proliferation and apoptosis of brain glioma．MethodsCulturing brain glioma cell line cells in vitro，inhibiting the expression of HSP70 with quercetin，utilizing flow cytometry，electronic microscopy and biochemical techniques，analyzing the growth，cell cycle of brain glioma after inhibiting the HSP70 expression were all the techneques applied in this study．ResultsQuercetin inhibited the growth of brain glioma cells cultured in vitro in a concentration-dependent manner．FCM analysis showed increase in cells in the G₂／M phase and decrease in the G₀／G₁ phase of the cell cycle．Subploidy peaks were found after treatment．Electron microscopy provided evidence that apoptosis occurred in the tumors of treatment groups．Such as densation and margination of chromatin，nuclei fragmentation．ConclusionThere is a correlation between HSP70 immunohistochemical expression and the degree of malignance of glioma．The expression of HSP70 on human glioma is of some prognostic significance．Quercetin markedly inhibites the growth of glioma cells in a concentration-dependent manner．

【Key words】Heatshock protein 70GliomaQuercetinProliferationApoptosis

由于生命是蛋白质的表现形式，任何基因都必须通过其特别表达的蛋白质而产生功能，因而与肿瘤发生发展相关的蛋白质引起了越来越多的重视，肿瘤的生物治疗又重新引起高度重视。

热休克蛋白是一类高度保守的蛋白质，虽然其功能尚未被完全认识，但已肯定它们与其他蛋白质的生成直接相关，其中最为重要的为热休克蛋白70类（HSP 70）^［1］。

已有许多报道证实，恶性肿瘤常常高表达HSP 70，并且在体内外许多不利于肿瘤细胞生长的环境中，具有保护肿瘤细胞的作用，严重影响抗肿瘤治疗的效果^［2］。

人脑胶质瘤几乎占颅内肿瘤的一半（35％～60％，平均44％），现有的临床治疗手段对人脑胶质瘤效果不佳。手术治疗由于仅能切除肉眼可见的肿瘤组织，且不能去除肿瘤发病的原因，因而无法避免术后的复发；放疗和化疗不但有严重的毒副反应，且有许多肿瘤细胞对其不敏感或很快产生耐受，有些甚至诱发新的肿瘤，因此疗效十分有限。

我们的早期研究表明，HSP 70在人脑星形胶质瘤细胞中高表达，与肿瘤的恶性程度成正比，严重影响抗肿瘤治疗的效果。临床资料也证实，高表达HSP 70的高恶性程度的人脑胶质瘤患者生存期往往较短^［3］。

槲皮素，3，3’，4’，5，7γ五羟黄酮，是生物黄酮中最具代表性的一种。过去只发现其具有抗感染、抗变态反应、扩血管和抑制血小板凝集的功能^［4］。最近研究表明，其可以特异性抑制肿瘤细胞HSP 70的表达，抑制大分子合成并阻断细胞周期，导致恶性肿瘤细胞死亡。

本研究在既往研究的基础上，深入探索脑胶质瘤细胞株在体外培养状态下，经不同浓度槲皮素处理不同时间后细胞的变化。观察槲皮素阻断脑胶质瘤HSP 70表达效率，初步明确其作用机理，同时分析细胞周期，观察HSP 70表达被阻断后对肿瘤细胞增殖的影响。

材料与方法

一、材料

1．主要仪器：CO₂孵箱，超净工作台，荧光显微镜，电子显微镜（HITACHI），流式细胞仪（FACSCan，美国BD公司产品），超速离心机。

2．主要试剂：HSP 70单克隆抗体，购于SANTACRUZ公司，IgG-FITC羊抗鼠抗体，购于基因公司，RPMI-1640（GIBCO公司产品），槲皮素，中国预防医学院劳卫所，批号911015。

二、方法

1．细胞培养：C6胶质瘤细胞株，是由Nγ甲硝基诱发的大鼠胶质瘤细胞，具有胶质瘤特异性标志GFAP和Sγ100蛋白。由中科院细胞所购得。培养于完全1640培养液中。

2．流式细胞仪分析细胞表面标志：观察C6胶质瘤细胞表面HSP 70表达情况。对数生长期细胞，以1×10⁶／管浓度离心，PBS洗三次，离心转速为?1500转／分，沉淀，加入1∶50稀释的单抗100μl，悬浮细胞4℃孵育45分钟，PBS洗三次，以0.2ml 1％甲醛PBS缓冲液悬浮细胞，流式细胞分析细胞表面HSP 70表达强度。

3．流式细胞仪观察细胞凋亡:?收集细胞制成单细胞悬液，PBS洗两次，1500转／分，5分钟×2次。200目筛网过滤2次。制备的单细胞悬液用70％乙醇固定，4℃保存。染色前用PBS进行离心沉淀，去除固定液，加120μlNaseA37℃水浴30分钟，至4℃避光保存30分钟，再加入50μl染色液混匀，至4℃避光30分钟，上机测试。记录激发波长488NM处红色荧光。

4．电子显微镜观察：经槲皮素处理后的胶质瘤细胞，离心沉淀包埋；前、后固定，漂洗；乙醇逐级脱水，每次10分钟；置换，包埋；60℃烘箱内48小时；柠檬酸铅染液染色；LKB超薄切片机切片；HITACHIH-500透射电镜观察；加速电压为80KV。

5．统计学处理：不同浓度槲皮素处理组肿瘤细胞抑制率与对照组作两两比较，Excel软件行t检验。

结果

一、不同浓度槲皮素对C6胶质瘤细胞生长的影响

经不同浓度槲皮素作用之后，C6细胞在不同时间的生长曲线变化明显。槲皮素抑制肿瘤细胞生长是浓度和时间依赖型，随着浓度的增加和时间的延长，肿瘤细胞被抑制的量也增加；同时也可看出，在细胞浓度为106／ml，作用时间为48小时时，24μM的药物浓度下，槲皮素抑制作用的效率曲线拟合度最好。说明在此情况下，即使再增加药物剂量，继续延长作用时间效率增加也并不明显。而且在48小时之后，曲线并不随时间和浓度的增加而陡升。各处理组与对照组抑制率检验结果，P值均小于0.05，有显著统计学差异。

二、PI染色荧光显微镜观察结果

荧光显微镜下凋亡细胞核或细胞质可见浓染致密的块状荧光。核碎裂和核固缩明显。

三、流式细胞仪检测结果

不同浓度槲皮素作用后细胞膜上HSP 70分子表达示胶质瘤细胞经槲皮素作用后细胞膜HSP 70表达减少；处理组细胞G₁峰左侧出现亚二倍体细胞群的峰型，对照组细胞则未见同样波形；经槲皮素处理的胶质瘤细胞，凋亡主要出现在G₀-G₁期。

四、电子显微镜观察

结果示染色质浓聚于核膜，呈境界分明的块状或月形小体。

讨论

恶性肿瘤是严重危害人民生命健康的疾病，是导致死亡的主要病因之一，发病率有进一步升高的趋势。从分子生物学角度讲，肿瘤形成源于细胞遗传物质的改变，而这种改变，造成了许多基本生命活动的变化，如细胞增殖、细胞分化和细胞凋亡等出现异常，所有这些改变都与蛋白质物质改变有关。

槲皮素被用于临床是因其具有抗血栓形成、扩血管等药理作用。但最近的研究证明，槲皮素可以通过抑制多种肿瘤细胞HSP 70的表达，发挥抑制肿瘤细胞生长的作用。本研究发现槲皮素可抑制胶质瘤细胞的增殖证实了以往的研究报道，并扩大了槲皮素可治疗的肿瘤细胞的范围。本研究发现，经槲皮素作用的肿瘤细胞，大都在细胞周期的G₀和G₁期出现凋亡，对S期细胞作用不大。分析细胞周期，可以看出凋亡细胞主要出现在G₀和G₁期，说明槲皮素主要抑制细胞的合成前期DNA，而这种作用的产生是通过抑制HSP 70的表达而实现的。说明作为一种分子伴侣，HSP 70在细胞的有丝分裂和DNA复制的过程中起着至关重要的作用，因为G