【摘要】目的建立囊胚培养系统以提高人胚胎的种植率。方法进行了12个治疗周期的囊胚培养，在受精后进行胚胎体外培养至第5天，达囊胚期后移植。结果共取卵177只，受精率67％，囊胚形成率为42％，囊胚种植率为14％，并获3例临床妊娠。结论囊胚培养为进一步提高临床成功率和开展种植前遗传学诊断创造条件，具有十分重要的应用前景。

The Application of Blastocyst Culture in IVF-ET

YANG Jianzhi，LIU Jiayin， HONG Lei.

（Department of Obstetrics and Gynecology，The First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University，The Jiangsu Province Key Lab in Reproductive Medicine, Nanjing，210029）

【Abstract】ObjectiveIn order to improve embryo implantation rate，we set up human blastocyst culture system and applied it in clinical treatment cycles．MethodsBlastocyst culture of 12 cycles were done．After being fertilized，embryos were cultured for five days．Then blastocysts were transferred into the uterus．ResultsOne hundred seventy-seven oocytes were retrieved．Fertilization rate was 67％，blastocyst rate was 42％， and blastocyst implantation rate was 14％．Three pregnancies were obtained．ConclusionThe application of blastocyst culture technique in IVF can improve clinical pregnancy rate and benefit preimplantation genetic diagnosis．

【Key words】BlastocystIn vitro cultureIVF-ET

体外受精-胚胎移植技术（IVF-ET）发展至今，在促排卵方案、胚胎培养技术及培养液的改进方面有了许多新的突破。但是如何提高较低的成功率始终困扰着生殖医学工作者。

在动物研究的基础上，近年发展的囊胚培养技术已被证明可使胚胎种植率大大提高，在国外的许多IVF中心，已将这作为常规技术进行应用，国内近年也已在少数实验室开展了这项研究。我们在1999年7月～1999年10月期间对囊胚培养这一技术进行了初步的尝试，共进行了12个囊胚培养的治疗周期，并获得3例妊娠。

材料和方法

病人的选择在1999年7月～1999年10月间，本实验室进行IVF及单精子卵胞浆内注射（ICSI）的病人中选择取卵数在10个以上者进行囊胚培养。其中＜30岁8例；30～35岁2例；＞35岁2例，平均年龄为31岁。不孕原因中，原发不孕为2例；继发不孕6例（其中5例有宫外孕病史）；男性因素不孕3例；另有1例其丈夫染色体为XXY型，采用供精受精。对这12例病人均采用GnRH-a／FSH＋HMG短方案促排卵，从月经第8天起每天B超监测卵泡大小，至少2个卵泡平均直径达1.8cm时注射人绒毛膜促性腺激素（hCG，Serono公司）10000单位。

胚胎培养及移植所用的培养液均预先配制并在单气孵箱内平衡过夜，注射hCG36小时后在B超介导下取卵，卵细胞培养于含10％血清代用品（SSS，IRVINE公司）的人输卵管液（HTF）中，取卵同时取精，精液液化后用Isolate（IRVINE公司）梯度离心法洗涤后备用。IVF病人每卵中加10～30万精子；ICSI病人在透明质酸酶中去颗粒细胞后选择有第一极体的成熟卵细胞进行ICSI操作，两者的卵细胞均单个培养于上盖矿物油的液滴中。16～18小时后IVF病人的卵在去除颗粒细胞后与ICSI病人的卵一起在倒置显微镜下观察受精情况，以出现2个原核者判定为正常受精。将受精后的卵细胞移入含10％SSS的P1培养液中，每24小时观察胚胎生长情况并分级，至受精后第3天达8细胞以上后移入含10％SSS的囊胚培养液中。至受精后第5天，视囊胚形成的多少对囊胚进行分级，取2～4个行宫腔内移植，多余的则冷冻保存。有2例在移植前用酸性Tyrode′s溶液在透明带上钻孔进行了辅助孵出（Assisted Hatching）。移植后每天肌肉注射黄体酮支持黄体，取卵后16～18天测尿hCG，阳性者于孕7～8周作B超检查，见到胚囊及胎心搏动者为临床妊娠。

结果

12例共取卵177只，平均每周期取卵15只；受精118只，受精率67％，卵裂率100％。取卵后第5天共形成囊胚50只，囊胚形成率为42％，12个周期均有囊胚移植，共移植了胚胎46只，其中扩展期囊胚11只，早期囊胚11只，晚期腔室期囊胚14只，融合期胚胎8只，形态不良胚胎2只，种植率14％，进行辅助孵出的2例均未种植成功。共获3例妊娠，其中2例为双胎。有6例对多余的胚胎进行了冷冻，共冷冻了36只胚胎，平均每个病人6只，拟在以后的自然周期解冻后移植。见插页图1、2。

图1受精后第3天的胚胎(400×)

图2受精后第5天的胚胎(400×)

讨论

通常IVF周期在取卵后2～3天进行胚胎移植，这时一般在4～8细胞期，成功率为10％～20％。而在体内，4～8细胞期胚胎尚位于输卵管中，因此在囊胚期进行胚胎移植使胚胎发育与子宫内膜同步，从而提高种植率，减少移植的胚胎数，为降低多胎妊娠率创造条件。另外胚胎生长超过8细胞期，有利于对胚胎进行筛选，有作者认为胚胎能否发育至囊胚与其自身的基因有关^［1］。因此，能发育至囊胚的胚胎应具有较高的种植能力。

同时因为8细胞期的胚胎基因组激活，更有利于对胚胎进行种植前遗传学诊断。有作者认为8细胞期后的胚胎才反映的是胚胎的生理特性，而8细胞前的胚胎反映的只是卵的生理特性^［2］。此时进行胚胎活检测定的是真正的胚胎指标，而不是卵的遗传特性。

另外，囊胚期进行活检，可提供更多的细胞来源，以避免活检对胚胎继续发育的影响^［3］。

在胚胎的生长过程中，环境中的各种成份一直在变化。因此，体外培养的不同时期胚胎对培养液成分的要求是不同的。8细胞期以前对培养液的要求较简单，而8细胞期以后，随着细胞的生长及分化，需要糖、必需及非必需氨基酸、核酸、维生素等成份。因此，以往使用的单一培养液显然是不够的，需要在不同时期采用不同的培养液。既往本实验室也尝试进行共培养，以使胚胎在普通培养液中生长达囊胚，但由于此方法较繁琐且存在污染问题，因此很快被专为囊胚培养所设计的序贯培养液所替代。在我们所进行的初步研究中，受精率为67％，囊胚形成率为42％，与文献报道基本符合，但未达到预期的种植率及妊娠率，究其原因，可能为：(1)本实验室开展IVF工作不到2年，所做病例数尚不够多，因此在培养技术上可能还不够完善，而且由于条件所限未采用对囊胚生长很有利的三气培养箱。因此可能对结果产生了影响。(2)本研究中继发不孕的病人所占比例较大，这些病人既往大多有炎症及异位妊娠史，可能对胚胎种植的环境有一定的影响。3例因男性因素不孕的病人中有2例妊娠，且均为多胎，提示囊胚的种植还与良好的子宫环境有关。

总之，囊胚培养已被公认是一种提高胚胎种植率，减少多胎妊娠的方法，本实验室对此进行了初步的尝试，并积累了一些经验，有利于进一步开展这项技术。同时在囊胚培养的基础上，我们还将继续开展种植前的辅助孵出及基因诊断技术，以使我省的生殖医学水平得以全面提高。

参考文献

1，Gardner DK，Phil D，Vella P，et al.Culture and transfer of human blastocysts implantation rates and reduces the need for multiple embryo transfers．Fertil Steril, 1998，69：84-88．

2，Scholtes MCW，Zeilmarker GH.A prospective，randomized study of embryo transfer results after 3 or 5 days of embryo culture in vitro fertilization．Fertil Steril, 1996，65：1245-1248．

3，Bolton VN，Wren ME，Parsons JH．Pregnancies after in vitro fertilization and transfer of human blastocysts．Fertil Steril, 1991，55：830-832．

（收稿：1999-12-14修回：2000-01-24）