关键词： CTLA4-Ig；外周血淋巴细胞；PHA；CD25

摘要目的：分析真核表达产物CTLA4-Ig对T细胞活化功能的影响。方法：构建并用真核表达系统表达CTLA4-Ig，通过蛋白A亲合柱纯化获得纯品；然后观察CTLA4-Ig对淋巴细胞转化功能及T细胞表面分子CD25表达的影响；用³H-TdR掺入法研究CTLA4-Ig对混合淋巴细胞反应的影响。结果：CTLA4-Ig抑制PHA对淋巴细胞的转化;同时，抑制PHA刺激的淋巴细胞表面CD25分子的表达，抑制率达53%，与对照相比抑制显著（P＜0.05），且这种效应有剂量依赖性；CTLA4-Ig抑制单向混合淋巴细胞反应，抑制率达87.53%，与对照相比亦抑制显著（P＜0.05），且效应亦呈剂量依赖性。结论：CTLA4-Ig能有效阻断T细胞的活化，并且阻断效应是通过多种信号途径起作用的。

中图分类号R972.6

EFFECTS OF HUMAN rECOMBINANT CTLA4-IG ON

lYMPHOCYTE ACTIVATION

Zheng Yu，Shen Beifen，Li Yan，Sun Yingxun，Shu cuiling，Hu Meiru，Yu Ming（Institute of Basic Medical Sciences of AMMS,Beijing100850）

AbstractAIM To study the effects of the recombinant CTLA4-Ig on lymphocyte activation.METHODS The recombinant protein of CTLA4 and Fc were expressed in eukaryotic system and purified by protein A;PBL were isolated and stimulated by PHA or the other PBL and CTLA4-Ig or human IgG, to obtain the data of CTLA4-Ig on the lymphocyte transformation, the expression of CD25 on the T cell surface and MLC.RESULTSCTLA4-Ig blocked the lymphocyte transformation,and expression of CD25 on the T cell surface by 53%, whereas the control of human IgG did not. CTLA4-Ig inhibited the reaction of MLC by 87.53%, which were significantly higher than the control of human IgG (P＜0.05).CONCLUSION The human recombinant CTLA4-Ig can block the lymphocyte activation through different pathway.

Key wordsCTLA4-Ig；PBL；PHA；CD25

CTLA4是维持体内T细胞稳定的负调控因子，它能抑制T细胞的活化，与维持T细胞活化、存活和增殖的CD28作用相反，二者构成了一对重要的免疫调控因子^［1］。目前，由CTLA4胞外段和人IgG fc段构建的融合蛋白CTLA4-Ig，被作为一种免疫抑制性制剂，对临床移植排斥反应有明显的抑制作用^［2、3］。在小鼠模型中，已证明该融合蛋白能够抑制同种异体器官的移植排斥反应，延长移植物的存活时间，而且与目前临床上使用的免疫抑制剂如FK506、CsA等联合使用，可降低后者的使用剂量及毒副作用。因此，我们构建并表达了CTLA4-Ig融合蛋白，观察了其对淋巴细胞转化及MLC反应的影响，并通过流式细胞术对该分子影响T细胞表面分子的表达进行了一些研究。

1材料与方法

1.1材料与试剂表达载体pIg，(由孙凯博士赠送)。内切酶(美国Biolab公司)。pGEM载体(美国Promega公司)。所用引物P1、P2、P3(本实验室全自动DNA合成仪合成)。CTLA4基因为本室保存。淋巴细胞分离液、肝素、生理盐水注射液、植物血凝素（PHA）。FITC-抗CD25抗体、PE-抗CD3抗体(美国BD公司)。AB血清、外周血来源于307医院血库。96孔板、多孔细胞收集器、β-液闪仪。³H-TdR(购自中国科学院原子能研究所)。

1.2方法

1.2.1CTLA4基因的改构用引物P1，P2和P3，通过引物重叠和半套式两次PCR，获得含抑瘤素M信号肽的CTLA4胞外片段,方法参见文献^［4］。

1.2.2CTLA4-Ig表达载体的构建将改造后的目的基因，经限制性内切酶EcoR v和BamH I消化后，连接至经相同内切酶处理的真核表达载体pIg中，酶切鉴定。PCR产物及载体的酶切、克隆及阳性重组子的鉴定，参见文献^［5］。

1.2.3细胞培养与转染调整CHO-K细胞至对数生长期。预先配制下述溶液：在100μl无血清、无抗生素的DMEM中，加质粒DNA5μg，混匀备用；在100μl无血清、无抗生素的DMEM中，加入20μl脂质体，混匀。将上述两种溶液混匀，滴加在欲转染的细胞表面，37℃，5% cO₂条件下培养5h～12h，换有血清培养液培养24h，再换无血清的DMEM培养48h～72h，收集上清液^［6］。

1.2.4免疫印迹检测目的蛋白表达上清液直接进行SDS-PAGE后，用抗人IgG fc段和抗人CTLA4的mAb，蛋白印迹法检测CTLA4-Ig。

1.2.5CTLA4-Ig表达产物的纯化表达上清液经超滤浓缩和/或PEG20000浓缩后，过蛋白A柱。用柠檬酸缓冲液洗脱，获得了纯化的CTLA4-Ig。

1.2.6淋巴细胞分离^［7］无菌取正常人外周血，用肝素抗凝。再用生理盐水稀释一倍，加于一定量的淋巴细胞分离液液面上，2000r/min，离心20min。取界面淋巴细胞，用生理盐水洗2～3次，悬于RPMI1640完全培养液，计数并调整细胞浓度。

1.2.7MTT法测定淋巴细胞转化^［8］细胞悬液调成1×10⁵～2×10⁵ml^-1，加至96孔培养板内，每孔100μl。CTLA4-Ig、人IgG及CHO表达上清液，每孔加10μl，以10μl无血清RPMI1640培养基作对照，用PHA刺激（终浓度为5μg·ml^-1），培养板置37℃，5％CO₂孵箱内培养72h。在培养结束前4h，加入浓度为5mg·ml^-1的MTT液10μl。培养结束后，吸去90μl上清液，加DMSO100μl/孔。充分振荡后在酶标仪上比色，测定波长为570nm。每个实验取3次测定的平均值，结果以转化指数计算。

转化指数=实验组OD570/阴性对照组OD570

1.2.8单向混合淋巴细胞培养（MLC）^［8］常规法分离出的外周血单个核细胞（MNC），悬浮于含20%人AB血清的RPMI1640培养液中。用剂量为25Gy的⁶⁰Coγ射线一次性照射，使细胞失去增殖反应性，作为刺激细胞刺激另外个体MNC。二者等量混合后植入96孔U型板，37℃，5%CO₂培养6d。掺入³H-TdR（1μCi/孔）再培养16h。用多孔细胞收集器将细胞收集于玻璃纤维滤纸上，水洗20s，空吸10s，然后干燥滤纸。最后将含样品的滤纸放入2ml闪烁液的闪烁瓶中，用β-液闪仪测定放射性强度（cpm）。

MLC实验结果分别以抑制率计算：

抑制率（%）=（1-实验组/对照组）×100

1.2.9流式细胞仪检测细胞表面分子^［9］常规法分离的淋巴细胞，以2×10⁶个/ml密度悬浮于RPMI1640培养液中。取50μl细胞悬液与20μl CTLA4-Ig混合。加入PHA，补液至20μl并使PHA终浓度为5μg·ml^-1。置37℃、5% cO₂条件下培养72h。收集细胞，用含2%小牛血清的PBS洗2次，然后加入相应CD3-FITC和CD25-PE的抗体，在冰浴、振荡条件下孵育30min。收集细胞，用2%的甲醛溶液固定保存。FCM分析。

T细胞中CD25表达阳性率的计算：

CD25阳性率（%）=CD25⁺CD3⁺/（CD3⁺+CD3⁺CD25⁺）×100%

2结果

2.1CTLA4表达质粒的构建（图1）由于CTLA4基因的信号肽序列不明确，为表达该基因的胞外段，需要引入抑瘤素M的信号肽^［4］，并为适合pIg载体的要求，在胞外段下游引物P3中，引入了表达载体要求提供的剪切供体ACTTACCTGT，引物序列如下：

图1plg-CTLA4质粒构建示意图

p1：5'GGGGATATCCACCATGGGTGTACTGCTCACA

cAGAGGACGCTGCTCAGTCTGGTCCTTGCACTC3'

p2：5'CTCAGTCTGGTCCTTGCACTCCTGTTTCCA

gCATGGCGAGCATGGCAATGCACGTGGCCCAGCC3'

p3：5'GCGGATCCACTTACCTGTAGAATCTGGGCA

cGG3'

用P2和P3引物，经半套式PCR扩增后，再用P1和P3引物，经引物重叠PCR，对CTLA4基因改构，获得抑瘤素M信号肽和CTLA4胞外段的融合基因。PCR产物经限制性内切酶EcoRV和BamH i酶切、电泳回收，连接至经相同酶切的表达载体pIg。该载体含有可融合的人IgG1Fc，并要求欲表达的基因含剪切供体，其自身带剪切受体。经酶切鉴定后，命名为pIg-CTLA4。最后，序列测定表明基因正确。

2.2CTLA4基因的真核表达及表达产物鉴定提取pIg-CTLA4质粒，转染COS7和CHO-K细胞，提取转染并经G418筛选的细胞基因组DNA，通过PCR扩增表明，确实将pIg-CTLA4转入表达细胞。收集表达上清液，用抗人IgG fc mAb和抗人CTLA4 mAb，通过免疫印迹证明在暂时性表达载体pIg中获得了表