提要设计构建了带有大肠杆菌外膜蛋白(OmpA)信号肽序列的重组分泌型表达载体pSE-hbFGF，在大肠杆菌DH5α中分泌表达了重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)。SDS-PAGE、免疫印迹及生物活性测定均表明表达产物分泌到细菌细胞周质和培养基中。分泌到周质中的rhbFGF可占周质总蛋白的15%。

SECRETION OF RECOMBINANT HUMAN bFGF

EXPRESSED BY E.coli

Yuan TaoZhang XuemeiHuang LinLi ChunyangWang JingWang Jiyuan

Xu LiuJiang LimingWang YanWang ZhijieXu Xiuzhen

(Chengdu Institute of Biological ProductsChengdu 610063)

ABSTRACTHuman basic fibroblast growth factor (hbFGF) gene was inserted into expression vector with OmpA signal sequence and expressed in E.coli DH5α. SDS-PAGE analysis, western-blot and bioassay verified that the expressed rhbFGF was secreted into culture medium and periplast of bacteria. The yield of rhbFGF secreting into periplast accounted for 15% of total periplast protein.

Key WordshbFGFE.coliSecretionExpression

碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是成纤维细胞生长因子家族中的一员，分子量为16～18 kD，是一种具有调控细胞增殖、分化功能的蛋白分子，可促进创伤愈合、骨修复、眼晶体再生及肢体再生等，具有广泛的潜在临床应用价值；并有可能开发成为治疗心肌梗塞、骨质疏松症和老年性痴呆等多种疾病的药物。由于分离和纯化天然的人碱性成纤维细胞生长因子(hbFGF)来源有限，因此，研究开发基因工程重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)就成了满足基础和临床应用研究需要的唯一途径。为此，设计构建了分泌型表达载体pSE-hbFGF在大肠杆菌脂蛋白启动子和乳糖启动子操纵子双重控制下，在大肠杆菌DH5α中分泌表达了hbFGF基因。

1材料和方法

1.1菌株、质粒和细胞株

含hbFGF cDNA的质粒pBluescript-hbFGF(自行构建)；大肠杆菌DH5α、分泌型表达质粒pSE均由实验室保存；3T3细胞株(中国生物制品检定所)。

1.2试剂

限制酶EcoRI、BamHI及Taq酶、dNTP、DNA连接试剂盒、Dig标记与检测试剂盒和NBT/BCIP显色液均购自德国宝灵曼公司；质粒提取试剂盒、PCR产物回收试剂盒(美国Promega公司)；鼠源性抗hbFGF单克隆抗体、IPTG(Sigma)；碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG/IgM(TAGO公司)；hbFGF生物活性检测标准品(中国生物制品检定所)；其余均为国产分析纯试剂。PCR扩增在PE9600扩增仪上进行。引物合成由美国赛百盛生物工程公司完成。

1.3斑点杂交

Dig标记探针的制备与斑点杂交操作过程均按宝灵曼公司的Dig标记与检测试剂盒说明书进行。

1.4分泌型表达载体的构建

酶切、连接、转化等基本操作均参照文献^［1，2］的方法略作修改。用斑点杂交法和酶切鉴别阳性克隆。

1.5重组菌的诱导表达

培养至对数的重组菌中加入IPTG诱导培养4～6 h。

1.6SDS-PAGE电泳

按Laemmli的方法进行^［2］。

1.7免疫印迹鉴定实验

参照文献^［2］的方法。

1.8生物活性检测

用MTT法检测样品刺激3T3细胞增生的活性。

2结果

2.1引物的设计

pSE分泌型表达载体部分前导肽及多克隆位点处的序列分别为：

根据文献^［3］报道的hbFGF cDNA序列，选择EcoRI和BamHI作为插入位点，设计合成了以下一对引物。

载体与hbFGF片段连接部位的核苷酸和氨基酸序列如下：

保留了EcoRI酶切位点，成熟蛋白跨膜时将有1、2、3三个可能的信号肽识别切割位点。如果跨膜时从1位切割，成熟蛋白N端将多出Ala-Glu-Phe三个氨基酸；而从2、3位切割将得到N端少2或3个氨基酸的hbFGF。从文献^［4］报道看，N端少几个到十几个氨基酸对hbFGF的生物活性无影响。实验结果已证明。

2.2分泌型表达载体pSE-hbFGF的构建

采用上述设计合成的引物，以含hbFGF cDNA的质粒pBluescript-hbFGF为模板进行PCR扩增。扩增时的复性温度为55℃。得到了约500 bp的扩增条带(图1)。利用两种酶EcoRI和BamHI分别消化载体pSE和PCR扩增产物，经0.7%琼脂糖凝胶电泳分离后分别回收线状质粒和PCR产物胶条，过柱纯化后用宝灵曼公司的Rapid DNA ligation kit连接，然后转化E.coli DH5α，用Dig标记探针杂交筛选阳性重组子，经EcoRI和BamHI双酶切证实插入片段大小正确(图2)。构建过程如图3。

Fig 1Detection of PCR products

1 500 bp ladder dsDNA marker2 480 bp PCR products

3 Negative template control

Fig 2Electrophoresis pattern of restrictive fragments of recombinants plasmids

1,2Plasmids containing insert fragments3 250 bp ladder dsDNA marker4,5 Plasmids without inserts

Fig 3Construction of recombinant secretion plasmid pSE-hbFGF

2.3重组菌的诱导表达与鉴定

根据表达载体的特点，hbFGF cDNA位于Lac操纵子片段下游，因此，只有在Lac诱导剂存在时才能表达。将构建好的重组菌pSE-hbFGF/DH5α接种于LB培养基中活化过夜后接种于HD培养基中培养到OD₆₀₀为0.5时加入终浓度为1 mmol/L的IPTG进行诱导，6 h后搜集菌液作SDS-PAGE和Western-blot鉴定。SDS-PAGE结果表明，在分子量约17 kD处的条带明显加深(图4)。Western-blot鉴定确证在约17 kD处有特异表达产物(图5)。

Fig 4SDS-PAGE analysis of expressed product

1pSE,IPTG induction for 6 h2-3 pSE-hbFGF,IPTG induction for 5,6 h4 Protein low molecular standard

Fig 5Western-blot analysis of expressed product

1 pSE,IPTG induction for 6 h2 pSE-hbFGF,IPTG indution for 6 h3 Protein low molecular weight standard

2.4hbFGF基因表达产物的定位

将发酵培养诱导菌液6 000 g离心10 min，分别收集上清和菌体。菌体加入新配制的高渗缓冲液，内含溶菌酶(1 mg/ml)、20%(w/v)蔗糖、30 mmol/L Tris-HCl (pH8.0)、1 mmol/L EDTA(pH8.0)，冰浴振摇10 min，6 000 g离心20 min，收集上清为周质组分；沉淀重悬于0.1 mol/L Tris-HCl(pH8.0)缓冲液中，反复冻融使细胞裂解，再以12 000 g离心5 min，上清为细胞质蛋白，沉淀部分为细胞膜组分和包涵体。对上述培养基上清、细胞周质、细胞质和膜碎片几部份分别作SDS-PAGE电泳、免疫印迹和生物活性检测，结果证明有活性的表达产物存在于细菌细胞周质和培养基中。SDS-PAGE检测到的周质目的蛋白与我们预计的在前导肽2或3位切割的产物大小一致，约为17 kd。SDS-PAGE扫描结果表明分泌至周质的rhbFGF约占周质总蛋白的15%。

3讨论

文献报道^［5］及我们以前构建的表达rhbFGF的工程菌多为大肠杆菌胞质型表达，表达量都不高，加之rhbFGF水溶性较好，在胞质中表达时主要以可溶性形式<