摘要通过用抗CD3,CD28+CD80 McAb激活健康人的PBLs,并以PHA,IL-2,PBLs为对照组;对各组不同时间段的淋巴细胞超微结构进行观察。结果提示:CD3及CD28+CD80除刺激淋巴细胞增殖外,也能使淋巴细胞活化;细胞表现为胞体增大,细胞器增多,具有粗大的绒毛和突出伪足,并可见单核细胞吞噬活跃。

中图号R392.1文献标识码:A

文章编号:1006-8783(2000)03-0191-03

Ultrastructural Study of PBLs Co-stimulated

with McAb in Culture System

GUO Wei-peng，ZHANG Kang，LIN Qing，CHENG Yong-xiong，LI Jun-yun(Wuzhou People's Hostital,Wuzhou,Guangxi 543000)

LUO Li-qiong，LIN Yue-xia，ZOU Yi(Guangdong College of Pharmacy)

AbstractIn this paper,the human healthy PBLs was activated with Anti-CD3 and CD28+CD80 McAb,with PHA, IL-2 and PBLs as controls. During different periods of activation, the ultrastructure of lymphocytes was observed under trans-electron microscope. The result indicated that beside stimulating lymphocytes proliferation, CD3, CD28+CD80 McAb could also activated lymphocytes.

Key wordsMcAb costimulation lymphocytes ultrastructure

近年来,肿瘤的生物治疗发展迅速,淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)的抗肿瘤作用已被许多实验证实^［1］。同时,T淋巴细胞的活化一直是免疫学研究的热点。在免疫应答过程中,抗原提呈细胞(APCs)将抗原信息传递给T淋巴细胞,需要两个信号的参与,第一信号由TCR/CD3复合物与MHCⅡ分子抗原肽相互作用,给予免疫应答特异性;第二信号即协同刺激信号,调节T细胞增殖性反应,以及效应功能的诱导,现在认为协同刺激信号在T细胞活化中起重要作用。CD80受体系统有两个成员,即CD28和CTLA-4,CD80与CD28结合,提供T细胞活化的协同刺激信号,此时诱导IL-2产生的信号^［2］。

有报道,抗CD28刺激能增强亚适量抗CD3作用下的T细胞增殖,同一情况下抗CD28可增强尿嘧啶的掺入,抗CD3单独刺激不增强尿嘧啶掺入;这提示刺激CD28能增强CD3刺激T细胞的代谢活性,这种增强作用,可能由于抗CD28刺激诱导特异性的T细胞效应分子的产生,其中重要的是诱导细胞因子的产生,而不依赖于细胞分裂增殖,CD28交联能特异地增强各种细胞因子的mRNA表达^［3］。

淋巴细胞的增殖和激活是免疫治疗的基础,作为一个阶段性的研究工作,我们通过形态学的研究,试图根据McAb共刺激PBLs在不同抗体和不同时间里淋巴细胞的形态变化,找出其与免疫治疗的相关性。

1材料与方法

1.1健康人外周血PBLs 50 mL(广州市血液中心,梧州市中心血站),加等体积Hanks液稀释,Ficoll密度梯度离心,收集淋巴细胞, Hanks液洗涤3次,计数,以1×10⁶/mL悬浮于RPMI 1640液(含φ＝10%小牛血清)中,并加入PHA,IL-2 200U/mL,CD3 McAb 70 ng/mL,CD28 McAb 2 μg/mL和CD80 McAb 2 μg/mL,37 ℃,φ=5%CO₂孵箱中培养2～13 d细胞达1×10^8/mL^［4］。

1.2透射电镜观察,各管加等体积前固定液(φ=2.5%戊二醛+φ=2%多聚甲醛)。离心(500 r/min),去上清,再加入相同固定液1 mL,固定2 h,离心2000 r/min。0.1 mol/L PBS洗3次,1% OsO₄固定1.5 h,清洗,脱水,EPON812包埋,超薄切片,透射电镜(日立,H-600)观察^［5］。

2结果与分析

2.1PBLs组,培养72 h，出现大量淋巴细胞凋亡(图1)；核异染色质密集，边聚，核膜、胞膜完整，同时有些细胞坏死，核固缩，染色质密集成半月状，胞膜溶解。96 h，坏死增多，至第10 d，坏死占细胞比例60%，至第13 d，占90%。

2.2IL-2组，培养96 h,淋巴细胞增殖活跃,出现一些大淋巴细胞;胞体大,胞浆丰富,核浆比例小，线粒体丰富，核大，常染色质丰富，可见核仁。同时见少量5%凋亡细胞，至11 d凋亡细胞增加至10%，细胞核固缩，异染色质高度浓集成黑洞形核，核膜、胞膜完整，内质网扩张；至13 d，大量细胞坏死溶解(图2)，约占90%。多数为核固缩性坏死，核质密集，细胞器、胞质肿胀自溶，胞膜、核膜均完整。

2.3PHA组，培养72 h，细胞较多，坏死细胞占20%，至96 h出现凋亡5%，培养10 d，坏死细胞比例上升至60%，13 d 80%。

2.4CD3组，培养72 h，细胞密集，增生活跃，出现大、中淋巴细胞。同时出现凋亡10%和坏死细胞20%;至96 h,坏死细胞比例高峰60%,120 h,坏死细胞比例下降,同时出现吞噬现象活跃,可见到单核细胞内含数倍于自身体积的异噬体,均为坏死细胞的残体,胞浆内可见多个溶酶体(图3),至10 d，坏死细胞达10%，11 d达20%，13 d达50%。

2.5CD28+CD80组，培养48 h，出现凋亡10%，其中有凋亡的中淋巴细胞，胞体较大，固缩，绒毛减少，胞膜核膜完整，核固缩，异染色质边聚。坏死细胞10%，72 h细胞密集，可见大淋巴细胞(图4)；细胞体积大，胞浆丰富，游离核糖体少，电子密度低，核大，常染色质为主，分布均一，核仁明显，同时，大部分的淋巴细胞体积增大，绒毛增多，增粗，有伪足样突起(图5)，核异形，有深切迹，呈马蹄状或回沟状(图6)，还可以见到凋亡小体(图7)：小部分有完整单位膜包裹的胞浆里含有固缩碎裂的染色质块，培养144 h，坏死细胞增加50%，至10 d降至30%，13 d仍可见60%正常淋巴细胞，也见凋亡的中淋巴细胞(图8)，胞体较大，固缩，绒毛减少，胞膜核膜完整，核固缩，异染色质边聚。

3讨论

本实验中CD3组和CD28+CD80组细胞增殖最强，IL-2、PHA组次之，PBLs组最弱。除CD3组，CD28+CD80组外，坏死细胞比值高峰均出现在时间末组(13 d)。CD3组高峰出现在96 h，CD28+CD80组出现在144 h，随后下降。至13 d又达高峰值,至于这两组出现峰值前移,其后下降现象,估计跟单核细胞被激活,大量吞噬坏死淋巴细胞而使其峰值下降有关。各组各时间段均可见凋亡现象，均在96 h以后达高峰。随后，随着坏死细胞的比例上升而下降。这也许因在体外培养体系中，凋亡细胞最终将发生溶解，即继发性细胞坏死^［5］，其表现为固缩性坏死征象。

综合结果表明，CD3与CD28+CD80刺激淋巴细胞增殖最明显，细胞密集，细胞体积较大，胞浆丰富，核常染色质较多，核仁明显，还见中淋巴细胞和大淋巴细胞。同时，CD3与CD28+CD80组淋巴细胞还表现为激活状态，细胞绒毛增多，增粗，突出伪足。

抗CD3抗体活化T细胞的可能机制是T细胞受体(TCR)的α和β双肽键由二硫键连在一起与CD3分子γ、δ、ε三条肽键连结形成TCR-CD3复合体的构型改变，触发T细胞内信号传递途径的激活和刺激后T细胞表达的各种粘附分子增加，增强了共刺激作用，使得T细胞的IL-2R的表达增加，对IL-2的反应增加，从而使细胞分裂增殖及细胞毒活性增强^［4，6］。

另外，CD80和CD28结合下能诱导协同刺激信号的产生，提供的第一信号下，诱导了IL-2的产生的信号占优势，因为它放大了免疫应答，阻止了CTLA-4诱导的apoptosis，当T细胞活化后，CD80和CD28结合下调CD28的合成，CTLA-4表达增加，在这种情况下，增殖性应答降低。CTLA-4的激活可以诱导已活化高峰在72 h至96 h后，凋亡继发性坏死也随之增加。

在实验中，各组均见有单核细胞(与淋巴细胞分离不纯有关)，在其他各组仅表现为胞体增大，胞浆丰富，溶酶体增多，而在CD3与CD28+CD80组，表现吞噬功能异常活跃；其胞浆所包含的异噬体比其自身体积大几倍。单核细胞这种吞噬功能异常活跃显然跟McAb刺激有关，此外，在这一过程中，坏死的细胞有否给予激活信号，这二者如何协调，信号如何激发、传递，单核细胞在免疫治疗的过程起何作用等，有待进一步研究。

本实验结果为肿瘤生物治疗用药时机提供依据，对肿瘤的T细胞治疗研究有重要意义。

(本文附图见封二)

图1健康人PBLs中凋亡的淋巴细胞(10000×)

图2健康人PBLs(IL-2 组，3500×)

图3健康人PBLs(CD3 组，4000×)

图4大淋巴细胞(6000×)

图5有伪足的淋巴胞(6000×)