摘要采用流化床技术与喷嘴结合的微型包囊法，将3种双歧杆菌、高效活菌保护剂和双歧促生因子一起作为核心物质，包封于无毒囊材中制成耐酸肠溶微囊(或微球)。微囊在人工模拟胃液(pH 1.5～2.0)中处理4 h，其中的双歧杆菌活菌数仍保持在44%以上；在人工肠液中处理12 min，微囊全部崩解释放出活性菌，在37 ℃下保存3个月(相当于常温下1年以上)，其中的活菌数仍大于10⁹个/g。有效地解决了胃酸、消化酶和抗生素等对活性双歧杆菌的灭活和产品常温保存期短的问题。

中图号R 392-33文献标识码:A

文章编号:1006-8783(2000)02-0087-04

Novel and High-Performance Microecological Viable Agent

Prepared with Microencapsulation Technology

YANG Ru-de，CHEN Hui-yin，XU Yan-bin

(South China University of Technology,Guangzhou,Guangdong,510641)

AbstractIn this paper, a new microencapsulation method which combined spray nozzle with fluid-bed technology was adopted to encapsulate three kinds of Bifidobacteria together with efficient agents of protection and Bifidobacteria factors in nonpoisonous polymer film to form acid-resisting,enteric-lysis microcapsules (or microsphere). Treated in artificial gastric solution (pH 1.5～2.0) for four hours, the amounts of viable Bifidobacteria in microcapsules prepared were still above 44%. When treated in artificial intestinal solution (pH6.8) for 12 minutes, they could be disintegrated and the viable bacteria released. More than 10⁹ per gram of bacteria remained alive after a three-month storage at 37 ℃(equivalent to one year at room temperature). This new method offera solution for keeping Bifidobacteria from being inactivated by gastric acid, digestive enzymes and antibiotics and prolong the storage period.

Key Wordsmicroencapsulation technology;novel and high-perform;preparation of viable Bifidobacteria

1引言

双歧杆菌是人体肠道正常的有益菌群，在健康人体肠道内占有绝对的优势。已经证明双歧杆菌具有扶正肠道菌群、抑制肿瘤因子、免疫赋活、生物拮抗等多方面的生态效应，因而具有维持肠道正常菌群平衡、抗感染作用、抗肿瘤活性、降低血液胆固醇、促进营养物的合成和吸收等保健功效^［1，2］。

到了20世纪80年代中后期，含有双歧杆菌的食品已开始大量进入我们的日常生活，并为人们广泛接受。至今，国内外含双歧杆菌的产品超过70种，以发酵乳制品居多，此外还有各种粉剂、片剂和胶囊等保健食品或生物制品^［3］。新开发的市售双歧杆菌活菌制剂还添加各种各样的“双歧因子”(主要是功能性低聚糖类)，使这类活菌制剂的保健效果更加显著。

但是，目前绝大多数微生态活菌制剂存在以下两个亟待解决的问题：①双歧杆菌活菌制剂经口服时，活性菌因不耐受胃酸、胆汁酸、消化酶及抗生素等的作用而极易失活；②双歧杆菌易受外界环境因素(主要是氧气、温度)的影响，常温下货架寿命短，产品常常要求在低温下保存销售，因而影响了该类产品的生产、销售和应用。本文报道将微囊化技术应用于微生态制剂中，即采用流化床与喷嘴结合的方法，将多种活性双歧杆菌、双歧因子和高效保护剂包封于具有抗渗性和肠溶性的复合囊材中，制成双歧杆菌微胶囊或微球，再加工成各种活菌制剂，从而大大提高了这类制剂口服时的活性菌存活率和常温下的保存期，成为一种新型高效的微生态制剂。

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1微生物菌种青春双歧杆菌(Bifdobacterium adolescentis),两歧双歧杆菌(B.bifidum),短双歧杆菌(B.breve)。以上3种菌种为华南理工大学生物工程系微生物室保存菌种。

2.1.2主要培养基

种子培养基(NPNL)：酵母浸膏0.5%，蛋白胨0.5%，大豆蛋白胨0.3%，L-半胱氨酸0.05%，可溶性淀粉0.05%，葡萄糖1.5%，促生因子1%，乳糖0.3%，吐温-80 0.1%，溶液A 1%，溶液B 0.5%。调pH值7.0，1 kg/cm²压力下灭菌10 min。

溶液A：K₂HPO₄10%，KH₂PO₄10%

溶液B：FeSO₄0．2%，MgSO₄·H₂O0．4%，MnSO₄*4H₂O0．15%，NaCl 0.2%

发酵培养基：脱脂牛乳10%，酵母浸膏0.05%，蛋白胨0.5%，促生因子0.5%；调pH 6.8～7.0，0.6 kg/cm²灭菌10 min。

固体培养基：于上述种子培养基中加入1.5%琼脂即成，用于双歧杆菌平板活菌计数。

2.1.3主要仪器设备冷冻真空干燥机(ALPHR 1-2),冷冻离心机(TGL-16G),厌氧培养箱(YQX),扫描电镜(S-510),超净工作台(LS-2),微囊化装置(自制)。

2.2实验方法

2.2.1冻干粉的制备将3种双歧杆菌分别移接于种子培养基中，37～38 ℃厌氧培养12～14 h后，以一定比例的接种量混合移接入发酵培养基中，在相同的温度下厌氧发酵培养14～16 h，离心取菌体，加入细胞保护剂和两种低聚糖，再进行冷冻干燥而成为冻干菌粉(包囊前再经磨碎、筛分)。

2.2.2囊材液的配制称取肠溶1号(ESI)囊材80 g于900 mL溶剂中，待ESI溶解后，再加入吐温-80及其他辅料(共100 mL)、混匀，即成为复合型肠溶囊材溶液。

2.2.3人工胃液和人工肠液的配制

人工胃液：取稀盐酸16.4 mL，加水约800 mL及胃蛋白酶10 g，搅匀后加水定容至1000 mL即可。

人工肠液：取磷酸二氢钾6.8 g加水500 mL。用0.4%的氢氧化钠溶液调节pH至6.8；另取胰酶10 g加水适量使溶解，将两液混合后，加水定容至1000 mL即可^［4］。

2.2.4微胶囊的制备采用自行设计的以流化床与喷嘴相结合的一套小型微囊化装置，直接在冻干菌粉微粒表面包囊上述复合肠溶囊材，得到粒径＜100 μm的微胶囊。

2.2.5微囊中活菌数的测定

称取1 g徽囊溶解于10 mL人工肠液中充分搅拌15 min使微囊崩解，再用旋涡振荡器使细胞充分分散后，按10倍稀释法倾注于平板上，置厌氧培养箱中培养2 d后计活菌数。

2.2.6微囊在人工胃液中的溶出测定

将0.1 g微胶囊置于盛有80 mL人工胃液(pH 1.2)的三角瓶中，于(37±0.5) ℃恒温水浴搅拌，搅拌速度＜200 r/min，分别于0，40，60，80，100，120 min时取样测其透光率，根据透光率变化来分析人工胃液中微胶囊的溶出情况。

2.2.7微囊在人工肠液中的崩解速度测定

将0.1 g微胶囊置于盛有80 mL人工肠液(pH 6.8)的三角瓶中，于(37±0.5) ℃恒温水浴搅拌，搅拌速度＜300 r/min，分别于0，5，10，15，25，35 min时取样测其透光率，据透光率变化来分析人工肠液中微胶囊的崩解溶出情况。

2.2.8微囊的恒温加速保存性实验

将3批双歧杆菌微胶囊分别以铂纸密封，37 ℃的恒温培养箱中放置3个月，每半个月取出1分(0.1 g)测其活菌数，同时，以铂纸密封的菌粉做对比实验。

3结果与讨论

3.1囊材及囊液浓度的选择

本研究对ESⅠ、ESⅡ和ESⅢ进行比较实验。从溶解性、成膜性，耐酸性、肠溶性、机械性能及喷雾性能等多方面进行了比较。综合考虑3种囊材的各种性能，发现ESⅡ、ESⅢ作为囊材显示了良好的溶解性、成膜性、耐酸性及肠溶性，但由于应用于喷雾时其不能很好地分散呈雾状，而是呈丝状，无法包囊菌粉。ESⅠ不仅各种性能良好而且能良好地呈雾状，显示了其独特的优点，故选择作为囊材，并添加入几种辅料以提高微囊的特性。

ESⅠ浓度并不影响微胶囊的大小，故对其浓度的选择主要是考虑其对喷雾性能的影响^［5］。比较了6%，8%和10%3种ESⅠ浓度，发现6%喷出来时呈雾效果差，囊液喷出速度过快，且呈雾区过高，不利于与菌粉充分接触；而当以10%ESⅠ实验时，囊液不容易被打散，液滴大且当通入热空气时喷嘴易阻塞；相对来说，8% ESⅠ呈雾效果好且不易阻塞喷嘴。

3.2微囊化操作条件的确定

在粉末包囊的过程中，即使是对于一定的囊心物和囊液，若操作条件不同，其微胶囊产品的特性差别也是极大的。笔者将操作条件归为空气流量及分布、气流温度、湿度和物料处理量三部分。在空气流量及分布中，包括了喷嘴位置及流化状态等内容。研究结果表明微囊化时最佳工艺条件为：无菌空气压力2～4 kg/cm²，流化床空气流量10～12 m³/h，喷嘴处气流量2.5 m³/