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中图号R 996.3文献标识码:A文章编号:1006-8783(2000)01-0011-03
A Chinese Cobra Venom proteinase，Natrahagin，
C1eaves Platelet Membrane Glycoprotein Ⅰb
and Inhibits Platelet Aggregation
GUO Dan
（Pharmaceutical Department of Nanfang Hospital）
WU Shu-guang,CHEN Na-na,ZHU Zheng-guang
（Institute of Pharmaceuti cal Sciences,The First Military Medical University,Guangzhou,P.R.China 510515）
AbstractObjective: To study the effect of natrahagin，a proteinase purified from Chinese cobra venom on platelet membrane glycoprotein Ⅰb(GPⅠb) and platelet aggregati on . Methods：SDS-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE) and densitometric sc anning were used to determined the hydrolysis of GPⅠb. The platclet aggregation was measured turbimetrically. Results：Natrahagin selectively degraded GPⅠb by cleaving a fragment with a molecular mass of about 3.3×104 Intravenous inj ection with natrahagin(0.025～0.1 mg/kg) significantly inhibited the aggregation of rabbit w ashed platelets induced by 100 U/L of thrombin in a dose-dependent manner. Conclusions：Natrahagin cleaved GPⅠb and exerted an inhibitory effect on GPⅠb-dependent platelet aggregation.
Key Wordscobra venom；platelet membrane glycoproteinⅠb；platele t aggregation
CLC numberR996.3Document code:AArticle ID:1006-8783(2000)01-0011-03血小板膜糖蛋白Ⅰb是血小板的主要糖蛋白之一，含有von Willebrand Factor(vWF)和高亲和力凝血酶的受体，是血栓形成早期介导血小板粘附激活的重要结构［1］。 研究表明，抑制GPⅠb与其粘附蛋白配基之间相互作用的药物，能够抑制血小板的聚集与粘附反 应，从而产生抗血栓的作用［2］。国外曾有报道从南美洲眼镜蛇毒中纯化出水解GPⅠb的蛋 白酶［3］，我们采用类似方法从中国眼镜蛇毒中分离纯化出蛋白酶natrahagin。本文研究该蛋白酶 对GPⅠb的水解作用和抑制血小板聚集的作用。
1材料和方法
1.1材料与仪器
Natrahagin由第一军医大学药物研究所从中国眼镜蛇粗毒(由广州医学院蛇毒研究所提供)分离纯化而得，生理盐水溶解配成所需剂量。阿尔新蓝8GX(Alcian blue 8GX)，香港Fa rco公司。凝血酶，Triton X-100，苯甲基磺酰氟(PMSF)，美国sigma公司。新鲜的人富血 小板血浆(PRP)，广州血液中心提供。新西兰家兔雌雄不限，体重(2.52±0.42) kg，由第一 军医大学实验动物中心提供。Mini-ProteinⅡ电泳系统，美国Bio-Rad公司。UVP-GDS750 0凝胶图像光密度分析系统，美国UVP公司。GS-15R离心机，Beckmen公司。SPA-4血小板聚 集仪，上海科达测试仪器厂。
1.2血小板膜糖蛋白的制备
参考阮长耿［4］和Huang［5］的方法改进。新鲜人血富血小板血浆(PRP)1 U( 约从200 mL 血中制备)1000 r/min离心10 min，弃去底部红细胞。取进一步纯化的PRP 2000 r/min离心1 0 min，用CGS液(NaCl 123.2，Glucose 30.2，Tri-sodium citrate 12.9 mmol/L)洗2次， 再用含3.5 mg/mL牛血清白蛋白的Tyrode′s液(NaCl 136.9，CaCl2 2，KCl 2.7，MgCl 2 2.1，NaH2PO4 0.4，NaHCO3 11.9，G1ucose 11.1 mmol/L)悬浮，并调整血小板 计数至1×1012个/L。取3.0 mL血小板悬液与0.25 mL 4 mg/mL的natrahagin组份 在37 ℃水浴孵育2 h后，加入终浓度为5 mmol/L的EDTA终止反应，3600 r/min离心10 min，沉淀 用10 mL Tyrode′s液洗1次，再用1.0 mL Tyrode′s液将沉淀悬浮，然后移入离心管内，2500 r /min 离心5 min，弃上清，沉淀内加入0.1 mL Tyrode′s液和0.1 mL血小板溶破液(50 mmol/L T ri s，2 mmol/L PMSF，1％BSA，1％Triton X-100)吹打约5 min。14 000 r/min离心15 min， 取上清，冷冻抽干备用。对照用0.25 mL生理盐水代替natrahagin溶液。
1.3血小板膜糖蛋白的电泳鉴定［6、7］
血小板冻干蛋白用0.1 mL蒸馏水溶解，加入0.2 mL含5％6-琉基乙醇的样品处理液，沸水内变性约3 min后备用。采用分离胶梯度为6％～11％的还原性SDS-聚丙烯酰胺垂直板 凝胶电泳进行鉴定，胶板面积16 cm×16 cm，厚度1.5 mm，上样体积0.1 mL。凝胶用PAS进 行 糖蛋白染色后，再放入用3％乙酸配制的1％阿尔新蓝8GX溶液内染色1 h，凝胶移入3％乙酸 内洗至背景清澈。电泳凝胶图像拍摄后，用BioGel/BioPro凝胶图像分析软件对凝胶区带进 行光密度分析，并比较natrahagin组与对照组光密度峰的变化。
1.4洗涤血小板的制备［8］
新西兰家兔由耳缘静脉注射给药后2 h从心脏穿刺取血3.0 mL，3.8％枸橼酸钠抗凝(9∶1)，1000 r/min离心10 min，取上层富血小板血浆。富血小板血浆再经3500 r/min离心10 min，倒去上清液，沉淀悬浮在5 mL Tyrode-Hepes缓冲液［(mmol/L)NaCl 137 ，KCl 2.58，NaHCO3 11.9，NaH2PO4 0.416，MgCl2 1，dextrose 0.555，Hepe 5；pH7.35］中。重复上述步骤1次，洗涤血小板(WP)最后悬浮在含0.35％牛血清白蛋白的 Tyrode-Hepes缓冲液中，调整洗涤血小板的血小板数目为3×1011个/L。
1.5血小板聚集率的测定［9］
用比浊法测定聚集率。取WP 200 μl，补充Ca2+至终浓度为1 mmol/L,37 ℃搅拌1 m in，加入诱导剂凝血酶使终浓度为100 U/L，在SPA-4型血小板聚集仪上描记聚集曲线。
1.6统计方法
文内数据用±s表示，进行成组t检验
2结果
2.1Natrahagin对血小板膜糖蛋白的水解作用
血小板膜糖蛋白在还原条件下的SDS-PAGE结果见图1。泳道2为未经natrahagin处理的对照组，存在分子量分别约为1.38×105，1.30×105和1.10×105的3种膜糖蛋 白的区带，分别为GPⅠb，血小板膜糖蛋白Ⅱb(GPⅡb)和血小板膜糖蛋白Ⅲa(GPⅢa)。泳道1为natrahagin处理组。血小板经natrahagin作用后，染色较深的分子量为1.38×105的区带消失，分子 量为1.30×105和1.10×105的区带仍然存在，1.05×105处出现1条新的蛋白区带。结果提 示，natrahagin选择性地水解GPⅠb，切除分子量约为3.3×104的片段。血小板膜糖蛋白SDS-PAGE电泳的 光密度分析结果见图2。血小板在natrahagin作用后GPⅠb的光密度峰己消失，而在分子量约为1.05×105处出现一新的光密度峰。1.30×105和1.10×105区带的光密度峰未见明显 改变。
图1Natrahagin水解血小板膜糖蛋白的
sDS-PAGE图谱
泳道1为natrahagin处理组；泳道2为生理盐水对照组
图2Natrahagin水解血小板膜糖蛋白的
凝胶电泳光密度分析图
A 生理盐水对照组；B natrahagin处理组
2.2Natrahagin对凝血酶诱导的血小板聚集的影响
Natrahagin静脉注射后2 h，与阴性对照组比，低剂量(0.025 mg/kg)、中剂量(0.05 mg/kg)及高剂量(0.1 mg/kg)均显著抑制凝血酶(100 U/L)诱导的兔洗涤血小板的聚集(图3)，效应呈剂量依赖性。3个剂量对血小板聚集的抑制率分别为20.4％、60.8％ 和77.5％。
