摘要本文报道了采用两种不同的方法制备5-Fu壳聚糖微球，微球A采用乳化交联法制备，微 球B是首先制备成白蛋白微球，然后在其表面固定壳聚糖。研究了微球的一些基本特征，包 括微球大小、形态与表面状态，结果表明微球A及微球B粒径主要分布在3.5～6.5 μm和0.6 ～2.8 μm范围内，药物含量分别为10.86%和8.52%，体外释放实验表明，在pH7.4磷酸盐缓 冲溶液中，微球B具有显著的缓释作用，其释放特征符合Higuchi方程。

中图号R944.9文献标识码:A文章编号:1006-8783(2000)01-0007-04

Preparation of 5-fluorouracil-loaded

Chitosan Microspheres

LIANG Gui-yuan,FANG Hua-feng,LIU Zhiwei

（College of Pharmacy, Tongji Medical University, Wuhan,P.R.China 430030）

AbstractChitosan microspheres loaded with 5-Fu were prepared with two different methods. Microspheres A were prepared by cross-linking-emulsion method. Microspheres B were prepared by two steps：BSA microspheres were first made and then covered with chitosan. The size of the two kind of microspheres was about 3.5～6.5 μm a n d 0.6～2.8 μm respectively. The drug loading was about 10.86% and 8.52% respec tively. 5-Fu release from mi crospheres B was sustained in phosphate buffer solution（pH 7.4） and it was ru led by Higuchi equation.

Key Words5-fluorouracil;chitosan;microsphere

CLC numberR944.9Document code:AArticle ID:1006-8783(2000)01-0007-04微球可在体内特异性分布，提高药效。以5-Fu为模型药物，采用合成的或 天然的高分子材料制备了各种微球，例 如：明胶、蜂蜡、乙基纤微素、牛血清白蛋白、纤微蛋白原、PLA等^［1,2］。壳聚糖 （chitos an）是天然多糖中唯一的碱性多糖，具有许多独特的物理化学特性和生物学功能。壳聚糖及 其分解产物无毒，具有生物相容性及生物可降解性，有抗菌消炎，促进伤口愈合，抗酸、抗 溃疡、降脂和降低胆固醇的作用，壳聚糖具有直接抑制肿瘤细胞的作用，并可通过活化免疫 系统显示抗癌活性，与现有的抗癌药合用可增强抗癌效果。近年来壳聚糖作为一种新型药用 辅料在缓释给药系统中的应用引起了人们浓厚的兴趣^［3，4］。已制备了包含有抗癌 药、消炎 药及生化制剂的壳聚糖微球。在此基础上，我们采用两种不同的方法制备了5-Fu壳聚糖微球 。

1材料与仪器

壳聚糖（脱乙酰度为80%，自制）、BSA（牛血清白蛋白，Sigma）、5-氟尿嘧啶（5-Fu上海 第十二药厂）、0.25%5-Fu溶液:上海旭东海善药业有限公司，本文HCl是指盐酸0.1 mol/L ，NaOH是指氢氧化钠0.1 mol/L；

小鼠：昆明种，18～20 g，雌雄各半，同济医科大学动物中心提供；瘤源小鼠：H₂₂ ，同济医科大学药学院提供；

TS14-2型分析天平、751-G紫外分光光度计、D40-2型电动搅拌机、UV-260 Shimadzuh紫 外分光光度计、SPC-1A超声波粉碎机、离心机、显微镜。

2方法与结果

2.15-Fu壳聚糖微球的制备

2.2.1微球A的制备

取壳聚糖200 mg于20 mL 5%的醋酸中，溶解并过滤，将20 mg 5-Fu溶于3 mL滤液中，混匀， 置于 250 mL烧瓶中，加入含6 g Span85及1 g吐温20的120 mL液体石蜡中。以1000 r/min的速度 搅拌2 0 min，超声均化10 min，然后倒入含有0.6 mL甲醛的乙醚120 mL中，以800 r/min继续搅拌 2 h， 放置。以3000 r/min离心后，分别用无水乙醇和乙醚洗涤、沉淀三次，真空干燥，得微球A 。

2.2.2微球B的制备

取5-Fu适量（约25 mg），加热溶解于1 mL H₂O中，稍放冷后，加入BSA约50 mg使溶解， 然后逐 滴加入到100 mL强力搅拌的蓖麻油中，加Span80 1 mL，超声均化20 min，倾入搅拌的乙醚 中， 加入甲醛0.2 mL，固化15 min，放置，离心，乙醚洗涤3～4次，挥尽乙醚，得白色固态的白 蛋白微球。

取壳聚糖100 mg于2%的醋酸溶液10 mL中，搅拌使其溶解并过滤，加入上述制备的白蛋白 微球100 mg，以1000 r/min的速度搅拌15 min，离心（10000～12000 r/min），分别用水、 乙醇、乙 醚洗涤，转移至平皿上，加少量丙酮分散后，在红外灯下40 ℃挥去丙酮。取干燥的微球细 粒 置盛有甲醛的真空干燥器中，微热，6 h后取出，挥去残留的甲醛，真空干燥，得微球B。

2.3微球的大小、形态

取微球少许，用含0.2%吐温80的生理盐水分散，在显微镜下观察微球的大小、形态。测定30 0个微球的粒径，并将数据进行处理。

本实验制备的两种壳聚糖微球，粒径大小均匀，微球外观为淡黄色粉末，光镜下微球外壳表 面光滑。生理盐水悬浮状态下，分散性和流动性良好。微球A，粒度主要分布在3.5～6.5 μ m；微球B，主要分布在0.6～2.8 μm，见图1。

Fig.1Scanning optical micrograph（magnification×400）of 5-Fu chitosan microspheres A and B

2.4灭菌实验

用⁶⁰Co发射的2.5×10⁴Gy为辐射剂量，对灌封于5 mL安培中的微球进行灭菌实验， 观察灭菌效果。

根据1995版中国药典规定的方法进行厌氧菌、需氧菌的检查，经2.5×10⁴Gy的γ-射线辐 射后，无上述菌落，达到了灭菌要求。

2.5紫外扫描

取5-Fu及壳聚糖适量溶于HCl中，以HCl作空白对照，于200～400 nm内紫外扫描。在265 nm处，5-Fu有较强的吸收，而相同浓度的壳聚糖、BSA吸收较小。可以用紫外分光光 度法测定5-Fu的量

2.6标准曲线的绘制

精密称取12.25 mg 5-Fu置于50 mL容量瓶中，加HCl溶解并定容至刻度。分别取0.5、1、1.5 、2.5、3 mL溶液于50 mL容量瓶中，加HCl定容至刻度，测定265 nm处A。

线性回归方程为：

A=0.0446C+0.0309（C：μg/mL）,r=0.998

2.7回收率实验

分别取适量5-Fu、BSA等溶解于10 mL水中，加NaOH约40 mL，加热回流2 h，放冷后，定容， 取适量用HCl稀释，测定265 nm处A值。

分别取5-Fu、壳聚糖适量，溶解于50 mL HCl中，定容并适当稀释，测定265 nm处A值。微球的消化方法一般常用酶消化法、酸碱消化法，由于壳聚糖不溶于碱，也未见有体外酶消 化壳聚糖微球之报道，对微球A我们采用HCl使壳聚糖溶解；对微球B，采用HCl使壳聚糖 先充分溶解，然后用NaOH溶液沸水消化白蛋白微球。我们测定了壳聚糖、碱消化对5-Fu回 收率的影响，回收率分别为(103.58±2.33)%、(102.1±1.13)%。

2.85-Fu壳聚糖微球的含量测定

取微球A约50 mg置于100 mL烧瓶中，加HCl 50 mL，搅拌回流6 h使微球完全溶解，放冷，定 容并稀释，测定265 nm处A值。

取微球B约100 mg置于100 mL锥形瓶中，用HCl 50 mL搅拌回流6 h，离心，将沉淀用HCl、水 洗涤 ，收集离心液、洗涤液，并过滤，得滤液Ⅰ。将离心所剩的沉淀置于100 mL烧瓶中，加NaOH 溶液约50 mL，加热回流2 h，过滤，得滤液Ⅱ。将Ⅰ、Ⅱ分别加水定容，并用HCl稀释，测 定265 nm处A值。

微球A中5-Fu的含量为10.86%，微球B含量为8.52%。据Sheu MT等^［5］报道，5-Fu在 油相 中具有适当的溶解性，由于其中一部分可分散到油相介质中，导致微球中药物含量大大降低 。微球B在表面包封壳聚糖时，也可能丧失一部分5-Fu。

2.9体外释放度的测定

将装有5-Fu壳聚糖微球的混悬液（约50 mg/2mL）的透析袋，置于98 mL pH7.4的PBS中。于 37 ℃动态透析。一定时间从外部溶液中取样1.0 mL。同时补充1.0 mL PBS。将所取样液用H Cl 稀释至5.0 mL后，测定A值，并计算累积释放度。为了考核是否有透析膜的控释作用，同时 以5-Fu原料作对照。

壳聚糖微球A、B体外释放结果见图2。微球A有一定的缓释作用，但缓释 效果不好。微球B有明显的缓释作用，其释放特征符合Higuchi方程（r=0.97）。

Fig.2Release behavior of 5-Fu from

chitosan microspheres A and B

2.10体内抗癌活性

取接种6～8 d的H₂₂瘤源小鼠，颈椎脱臼致死，用无菌<